专利名称：小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及制备抗肿瘤药物，尤其涉及具有抗肿瘤作用的小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物及其制备方法。
背景技术：
利用抗体对肿瘤特异抗原的选择性，对抗肿瘤药物进行主动靶向设计，可提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性，降低其对正常器官的毒性。目前，抗体药物的研究主要有两个方向一个是抗体药物的小型化。由于抗体及其偶联物均为大分子物质。IgG型抗体的分子质量约为150kD，庞大的抗体或偶联物分子难以通过毛细管内皮层和细胞外间隙到达实体瘤深部的肿瘤细胞。因此，研制小型化抗体药物对提高疗效有重要意义。通过酶切方法获得的Fab片段，其分子质量约相当于完整抗体的1/3。研究表明，抗体片段较易穿透细胞外间隙到达深部的肿瘤细胞。与完整抗体相比，抗体片段的免疫原性较弱。使用抗体片段， 可降低人体的抗体反应。另一个研究方向就是抗体药物的高效化。抗体连接上对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的“弹头”，可降低药物的用量及对其他器官的毒性，还可以减少治疗费用。早在本世纪70年代初，美国哈佛大学Judah Folkman博士就正式提出肿瘤的发生、发展和转移都与肿瘤血管生成(Tumor Angiogenesis)密切相关，因此靶向肿瘤血管生成的治疗策略就显得尤为重要。研究表明，Endoglin高表达于各种肿瘤组织及肿瘤组织边缘血管起源的内皮细胞，但很少出现在正常组织的内皮细胞，是肿瘤血管生成的标志性分子之一，可作为肿瘤抗血管治疗和靶向治疗的重要靶点。阿霉素(AdriamyCin，ADM)是一种抗肿瘤抗生素，可严重干扰DNA的合成、DNA依赖性RNA合成和蛋白质合成，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。本文将初步探讨小型化的Endoglin抗体片段与阿霉素偶联物的抗肿瘤作用。

发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物，该偶联物Fab-ADM不但有更强的肿瘤抑制效果，还可显著延长荷瘤动物的生存时间。为实现上述目的，本发明的技术方案为提供小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物，其中，偶联物Fab-ADM是由N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯 (MBS)作为交联剂，MBS首先与一含有-NH2的分子即阿霉素(ADM)反应并稳定结合为活性的中间产物，然后再与一含有-S-的分子即为经胃蛋白酶消化、二硫苏糖醇(DTT)还原的抗体片段Fab反应得到终产物，即偶联物Fab-ADM ；Fab与ADM的分子比为1 2。本发明还提供小型化Endoglin抗体与阿霉素偶联物的制备方法包括以下步骤(1)、选用MBS作为交联剂备用；(2)、阿霉素的MBS修饰阿霉素的MBS修饰调整阿霉素浓度为10mg/ml，MBS浓度为ang/ml，以MBS与阿霉素摩尔比为10 1调整反映体系，于室温反应30min后，立即与巯基化的单抗混合。
(3)、Endoglin抗体片段Fab的巯基化 经饱和硫酸铵沉淀及丙烯葡聚糖凝胶S-200HR (Sephacryl S-200HR)纯化得到的单抗分子，与胃蛋白酶反应时的分子比约为20 1，37°C，反应3-6小时，反应体系pH值为 4. 5 ；反应结束后，加入2M的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，pH8.0终止反应；调整经^^！！肌巧工 S-200HR凝胶柱纯化所得的F(ab' )2浓度为10mg/ml，加入二硫苏糖醇(DTT)还原，其终浓度为50mM，室温反应30min，脱盐后立即与步骤O)中的MBS修饰的阿霉素偶联。0)、偶联物的制备MBS修饰的阿霉素与巯基化单抗的摩尔比为约15 1，室温反应18h;偶联物过 Sephacryl S-200HR凝胶柱纯化并超滤浓缩，于吸光度^Onm处测定蛋白浓度。


图1为偶联物的制备原理图；其中A :MBS反应原理图(引自Bioconjugate Techniques (2nd Edition), Greg Τ. Hermanson, P287) ；B :阿霉素；C :经胃蛋白酶消化、DTT 还原所得的抗体片段Fab ；D 抗体经胃蛋白酶消化示意图(来自hternet :http://www. binglixue. com/zhikao/yaodian/jichu/my05. htm)；图2为MTT法分析游离ADM与偶联物Fab-ADM对肝癌细胞株BEL-7402的体外增值抑制率；图3为荷瘤小鼠在不同监测点的肿瘤体积；图4为荷瘤小鼠在不同监测点的存活率。
具体实施例方式1材料与方法1.1 材料1. 1. 1实验动物及细胞株分泌抗Endoglin单克隆抗体的杂交瘤细胞株、肝癌细胞株BEL-7402由本实验室保存，小鼠肝癌H22细胞株来源于中国典型培养物保藏中心；体重18-22g的清洁II级昆明种雄性小鼠由广东省医学实验动物中心提供。1. 1.2药品与试剂盐酸阿霉素(盐酸多柔比星)为意大利Pfizer Italia S. r. 1.公司产品。 Sephacryl S-200HR凝胶购自GE公司；浓缩超滤管购自Millipore公司。异型双功能偶联齐[JMBS (m-Maleimidobenzoyl-N—hydroxysuccinimide ester)购自 Sigma公司。蛋白 Marker 购自！^ermentas公司。胃蛋白酶购自Amersco公司。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所。DMEM干粉及FBS购自Gibco公司。其他常规生化试剂均为国产分析纯。1. 2 方法1. 2. 1抗体偶联物制备1. 2. 1. 1抗体偶联物制备原理偶联物的制备选用MBS作为交联剂，MBS的作用机制见图1A，MBS首先与一含有-NH2的分子R(在本实验中为阿霉素(结构式见图IB))反应并稳定结合为活性的中间产物，然后再与一含有-S-的分子R'(本实验中为经胃蛋白酶消化、DTT还原的抗体片段 Fab(图IC))反应得到终产物，即偶联物。胃蛋白酶作用于完整的抗体分子后，可将IgG重链间二硫键近C端切断，得到一个具有两价抗体活性的F(ab' )2段，还有Fc段的小部分 (此时Fc段的大部分都水解成较小分子的肽，不呈现任何生物学活性)(图ID)。F(ab' )2 经DTT还原后可暴露出二硫键与交联剂结合(图1C)。1. 2. 1. 2阿霉素的MBS修饰调整阿霉素浓度为10mg/ml，MBS浓度为ang/ml，以MBS与阿霉素摩尔比为10 1 调整反映体系，于室温反应30min后，立即与巯基化的单抗混合；1. 2. 1. 3Endoglin抗体片段Fab的巯基化经饱和硫酸铵沉淀及丙烯葡聚糖凝胶S_200HR(S印hacryl S-200HR)纯化得到的单抗分子，与胃蛋白酶反应时的分子比约为20 1，37°C，反应3-6小时(最佳反应为 3小时)，反应体系pH值为4. 5。反应结束后，加入2M的Tris，pH8.0终止反应。调整经 Sephacryl S-200HR凝胶柱纯化所得的F (ab ‘ ) 2浓度为10mg/ml，加入DTT还原(其终浓度为50mM)，室温反应30min，脱盐后立即与MBS修饰的阿霉素偶联。1.2. 1.4偶联物的制备MBS修饰的阿霉素与巯基化单抗的摩尔比为约15 1，室温反应18h ；偶联物过 Sephacryl S-200HR凝胶柱纯化并超滤浓缩，于吸光度^Onm处测定蛋白浓度。1. 2. 1. 5偶联物中Fab与ADM的分子比计算根据吸光度的加和性，可以在同一试样中不经分离同时测定两个以上的组分。AaSOrrSpab CFab+S^icADMA232.S=^illf Cpab+S^MCADMCadm /Cpab—(Spab 5 -Rspab)/R = A232. 5/A280上述公式中，A表示吸光度，A= ebc，其中ε为吸光系数，单位L/(g · cm)，b为液层厚度(通常为比色皿的厚度)，单位cm，c为溶液浓度，单位g/L。1. 2. 1. 6 非还原 SDS-PAGE 检测采用非还原SDS-PAGE检测偶联物的大小。分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为 5%，电泳电压为100V，时间为80min。1. 2. 2偶联物的体外细胞增殖抑制试验选用MTT法进行检测。取对数生长期的BEL-7402细胞，计数并调整细胞浓度为 3000个/100 μ L，每孔加IOOyL于96孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2的培养箱中培养 24h0加入以无血清DMEM倍比稀释的ADM及偶联物Fab-ADM各10 μ L/孔，每个浓度设3个平行孔，同时设空白对照孔，阴性对照孔加无血清DMEM培养液10 μ L。继续培养72h，每孔加入10 μ L MTT溶液，在细胞培养箱内孵育4h后，每孔加入100 μ L Formanzan溶解液，继续孵育4h左右，于570nm处测定吸光度并计算肿瘤抑制率和IC50值。抑制率(％ ) = (1 一实验组OD值/对照组OD值)X 100%。并根据IC50值计算偶联物的体内使用剂量偶联物体内实际用药剂量=游离ADM剂量X (偶联物的体外IC50/游离ADM体外IC50)。IC50 的计算方法为改良寇式法lgIC50 = Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
其中Xm: Ig最大剂量I Ig (最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和Pm 最大阳性反应率Pn 最小阳性反应率1.2. 3偶联物的体内肿瘤抑制试验昆明小鼠，雄性，体重18_22g，随机分组，每组10只。小鼠肝癌细胞株H22经小鼠腹腔传代一次，收集腹水细胞，以生理盐水按1 3稀释后，接种于小鼠右腋皮下，0.2ml/只 (约2X106个细胞/只)。待肿瘤体积生长到约4X6mm大小时，开始用药。给药方式为尾静脉注射，对照组给予生理盐水0. aiil/只，ADM剂量为0. %ig/kg，偶联物体内用量表示为等细胞毒性剂量0. %ig/kg，Fab剂量亦为0. %ig/kg。每周给药一次，连续3周给药。实验期间，每周测量2次肿瘤的长径a和短径b，以公式V = O. 52ab2计算瘤体积(V)，绘制肿瘤生长曲线，并计算抑瘤率。观察动物生存情况，以Kap Ian-Meier法计算中位生存时间。统计学处理各组动物的肿瘤体积均用mean 士 SD表示，组间分析采用t检验。2 结果2. 1偶联物中Fab与ADM的分子比计算制作标准曲线求出ε值，R = 0. 722/0. 298 ^ 2. 42, cADM/cFab 2，分子比 Fab ADM=I 2。偶联物中Fab与ADM的分子比为1 2，说明一个Fab分子结合了两个ADM，根据MBS的特性，偶联物中也应该含有两个MBS分子，根据该假设，可估算出偶联物的分子量为 MFab+2MADM+2MBS 51788Da。2. 2 非还原 SDS-PAGE 检测偶联物的分子量与估算的大致相符。2. 3偶联物Fab-ADM的体外肿瘤细胞增殖抑制作用以MTT法测定Fab-ADM偶联物及ADM对体外培养的BEL-7402肝癌细胞的细胞毒作用。结果见图2。根据公式计算ADM和Fab-ADM偶联物对肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制的IC50分别为3. 15ug/ml和124ug/mL·若计算为等细胞毒性剂量，Fab-ADM的IC50值为 2. 78，该数值与游离ADM的IC50值差异不大，这可能与BEL-7402不是Endoglin的靶细胞有关。动物实验中，游离ADM采用0. 4mg/kg的剂量，根据IC50值推算出偶联物Fab-ADM 的实际使用剂量为15. 75mg/kg，但表示为0. 4mg/kg的等细胞毒性剂量。2. 4偶联物的体内肿瘤抑制试验小鼠皮下接种肝癌H22后，待肿瘤体积生长到约4X6mm大小时，开始用药治疗。肿瘤生长曲线如图3所示。与游离ADM相比，等细胞毒性剂量的偶联物Fab-ADM能显著抑制 H22的生长。根据肿瘤体积计算药物的抑瘤率用药第14天，ADM(O.^ig/kg)的抑制率为 25%，偶联物(0. %ig/kg，等细胞毒性剂量)的抑制率达到91. 94%;而第21天时，ADM治疗的荷瘤小鼠均死亡，偶联物的抑制率仍为87. 00%，抑制作用较ADM显著增强(P < 0. 05)。观察动物的生存状态及生存时间，结果显示(图4)偶联物Fab-ADM治疗组的中位生存时间约为32天，而ADM治疗组的约为14天。这说明与游离ADM相比，偶联物Fab-ADM 不但有更强的肿瘤抑制效果，还可显著延长荷瘤动物的生存时间(P < 0. 01)。
3 结论Endoglin抗体片段Fab经MBS与阿霉素的偶联产物Fab-ADM大小约51788Da，体内实验中，Fab-ADM能显著抑制H22的生长。根据肿瘤体积计算药物的抑瘤率用药第14 天，ADM(0. 4mg/kg)的抑制率为25%，偶联物(0. %ig/kg，等细胞毒性剂量)的抑制率达到 91. 94% ；而第21天时，ADM治疗的荷瘤小鼠均死亡，偶联物的抑制率仍为87. 00%，抑制作用较ADM显著增强(P < 0. 05)。偶联物Fab-ADM治疗组的中位生存时间约为32天，而ADM 治疗组的约为14天。这说明与游离ADM相比，偶联物Fab-ADM不但有更强的肿瘤抑制效果， 还可显著延长荷瘤动物的生存时间(P < 0. 01)。以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
权利要求
1.小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物，其特征在于偶联物Fab-ADM是由MBS作为交联剂，MBS首先与一含有-NH2的分子即ADM反应并稳定结合为活性的中间产物，然后再与一含有-S-的分子即为经胃蛋白酶消化、DTT还原的抗体片段Fab反应得到终产物，即偶联物；Fab与ADM的分子比为1:2。
2.如权利要求1的小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物的制备方法包括以下步骤(1)、选用MBS作为交联剂备用； 0)、阿霉素的MBS修饰调整阿霉素浓度为10mg/ml，MBS浓度为ang/ml，以MBS与阿霉素摩尔比为10 1调整反映体系，于室温反应30min后，立即与巯基化的单抗混合； (3)、Endoglin抗体片段Fab的巯基化经饱和硫酸铵沉淀及丙烯葡聚糖凝胶S-200HR纯化得到的单抗分子，与胃蛋白酶反应时的分子比约为20 1，37°C，反应3-6小时，反应体系pH值为4.5;反应结束后，加入2皿的Tris，pH8.0终止反应；调整经丙烯葡聚糖凝胶S-200HR凝胶柱纯化所得的F(ab' )2浓度为10mg/ml，加入DTT还原，其终浓度为50mM，室温反应30min，脱盐后立即与步骤⑵中的MBS修饰的阿霉素偶联； G)、偶联物的制备MBS修饰的阿霉素与巯基化单抗的摩尔比为约15 1，室温反应18h;偶联物过丙烯葡聚糖凝胶S-200HR凝胶柱纯化并超滤浓缩，于吸光度^Onm处测定蛋白浓度。
全文摘要
本发明提供小型化Endoglin抗体与阿霉素的偶联物及其制备方法，偶联物为Fab-ADM；Fab与ADM的分子比为1∶2。制备方法包括(1)选用N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)作为交联剂备用；(2)阿霉素以异型双功能交联剂N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基)苯甲酸酯(MBS)修饰(3)Endoglin抗体片段Fab的巯基化；(4)偶联物的制备。该偶联物Fab-ADM不但有更强的肿瘤抑制效果，还可显著延长荷瘤动物的生存时间。
文档编号A61K47/48GK102258789SQ201010624459
公开日2011年11月30日 申请日期2010年12月29日 优先权日2010年12月29日
发明者周松林, 林映莹, 王 华, 谭光宏, 赵焕阁, 郭峻莉, 黄用豪, 黄风迎 申请人:海南医学院