专利名称：一种治疗眼睛血管增生的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质，具体涉及一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质。
背景技术：
致盲的原因有多种，由于各种原因导致眼睛的血管增生是主要的致盲原因之一。 引起眼睛的血管增生的常见病因有1、各种慢性进行性高血压或动脉硬化以及视网膜静脉炎等疾病并发的视网膜中央静脉总干或分支阻塞和糖尿病视网膜病变等引起的视网膜大面积慢性毛细血管缺血、缺氧、产生血管生成因子，从而导致新生血管形成。2、早产儿视网膜病变，多见于过量吸氧。早产儿视网膜尚未发育完善，以周边部最不成熟，处于高氧环境下，视网膜血管收缩、阻塞，使局部缺血、缺氧，诱发视网膜血管异常增生。3、渗出性年龄相关性黄斑变性、病理性近视等眼底退行性变性。大多位于后极部，是典型的脉络膜毛细血管一玻璃膜一视网膜色素上皮复合体病变。玻璃膜连同色素上皮皲裂，脉络膜血管增生并由皲裂处向视网膜神经上皮层下生长。4、各种原因所致的角膜损伤、溃疡或炎症引起的角膜或结膜血管增生。目前对于上述原因所致的眼睛的血管增生主要是采取中医疗法或激光等物理疗法，但是疗效不理想，尚没有特效的抑制眼睛的血管增生的药物。致使血管增生导致的盲症还没能得到有效的控制，而是随着老龄人口的增加等原因，血管增生所致的盲症呈增多之趋势。当前，亟待于开发新的抑制眼睛血管增生的药物。

发明内容
本发明的目的是提供一种治疗眼睛血管增生的蛋白质。是通过DNA序列合成方法合成一段DNA序列，将这段DNA序列重组于毕赤酵母中表达，表达产物活性分析证明，所合成基因编码的蛋白具有抑制血管新生和治疗眼睛血管新生的功能。其核苷酸序列和它的氨基酸序列如序列表中所述。本发明的目的是通过以下技术措施实现I. DNA序列的合成设计如下DNA序列，并用套叠PCR方法进行其序列合成。将其序列命名为sin。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2. DNA序列编码蛋白功能的证明(I) DNA序列重组于酵母中表达通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，将以上合成的DNA片段插入毕赤酵母表达载体PGAP9K的多克隆位点，将其表达载体命名为pGAP9K-sin(附图I)。用电转法将 pGAP9K-sin 转化毕赤酵母 GSl 15，获得工程菌 GSl 15 (pGAP9K_sin)。用 BMGY-BMMY 发酵 GS115 (pGAP9K-sin)诱导表达 Sin 蛋白。(2)表达产物活性分析发酵液上清过Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱进行纯化(附图2)，收获的含目标蛋白的液体经过抽滤除盐后，进行抑制抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成试验，制成眼药水进行治疗大鼠视网膜血管增生模型和治疗猴子血管新生模型。结果是Sin蛋白抑制鸡胚绒毛尿囊新生血管生成，其对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的抑制作用强于Angiostatin (附图3)， 显著地抑制大鼠视网膜血管新生(附图4)，能治愈猴子眼睛血管增生模型，具有治疗眼睛血管新生的作用。利用上述蛋白质制备药物，可用于治疗人眼睛血管增生，是一种治疗眼睛血管增生的药物。本发明的优点本发明人工合成sin基因，将sin基因重组于毕赤酵母基因组进行表达获得的Sin 蛋白，将表达产物纯化后获得的Sin蛋白能有效地抑制抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管新生，具有治疗眼睛血管增生的功能。血管生成抑制因子在治疗血管增生性疾病中有着重要的用途。虽然已发现的血管生成抑制因子有多种，但是本发明的血管生成抑制因子基因序列小， 分子量小的药物有利于在机体内的传输，并且Sin蛋白抑制血管生成的作用较强。为生产特效的治疗眼睛血管增生的药物的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。


附图I.构建含sin基因的毕赤酵母表达载体附图2 发酵 GS115(pGAP9K-sin)表达 Sin 蛋白M.蛋白 Marker ；0. GS115 (pGAP9K)(负对照)；1. GS115 (pGAP9K_sin) ；2.纯化的 Sin蛋白。附图3. Sin蛋白抑制鸡胚绒毛尿囊膜新血管生成试验a. PBS ;B. Sin 蛋白(20 μ g) ；C. Angiostatin (20 μ g)附图4. Sin蛋白抑制糖尿病大鼠的视网膜血管增生a.右眼(滴PBS) ；b.左眼(滴Sin蛋白)
具体实施例方式I. DNA序列的合成(I)设计如下DNA序列。ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA(2)合成如下引物PI · 5，ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAG3，ρ2· 5’ TGTATCCACTCCAGAGTTTGTTCATGCCCACCGGGCACATGGGCTCCTGGTCCGTTTG3’
ρ3·5， TCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGAC3，ρ4· 5，GCATGGTGCTGAACCGCGCCAGGCAGGAGCCCGCCAGCCCCAGGTCCTGGTTGTGCGC3’ρ5·5， GGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTATGCCAGC3，ρ6·5，GGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCAGTAGGACTTGTCGTTCCGGCTGGCATAGTAGCA6，ρ7·5， CACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACC3，ρ8·TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGA3，(3)用如下套叠PCR法进行以上序列的合成，其步骤是①应用Pl和ρ2引物进行PCR，获得产物I。②用Ρ3和ρ4引物进行PCR扩增，获得产物2。 ③用Ρ5和ρ6引物进行PCR扩增，获得产物3。④用Ρ7和ρ8引物进行PCR扩增，获得产物4。⑤以上获得的底物1、2、3、4的混合物为底物，用引物Pl和ρ8进行扩增，获得产物 5.(4)将以上PCR产物5进行DNA序列分析证明所获的DNA序列与设计的一致ATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGAAGCACAGCCAAACGGACCAGGAGCCCATGTGCCCGGTGGG CATGAACAAACTCTGGAGTGGATACAGCCTGCTGTACTTCGAGGGCCAGGAGAAGGCGCACAACCAGGACCTGGGG CTGGCGGGCTCCTGCCTGGCGCGGTTCAGCACCATGCCCTTCCTGTACTGCAACCCTGGTGATGTCTGCTACTAT GCCAGCCGGAACGACAAGTCCTACTGGCTCTCTACCACTGCGCCGCTGCCCCTTAAGGTCGACAAGCTTGCGGCC GCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA2.序列编码蛋白功能的证明(I)DNA序列重组于酵母中表达及其表达产物的纯化通过DNA内切酶和T4DNA连接酶的作用，将以上合成的DNA片段插入毕赤酵母表达载体PGAP9K的多克隆位点，将其表达载体命名为pGAP9K-sin(附图I)。用电转法将pGAP9K-sin转化毕赤酵母63115，获得工程菌63115( 64 91(-8丨11)。用YB)培养基发酵 GS115(pGAP9K-sin)表达Sin蛋白(附图2)。将发酵液上清过Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，获得符合标准分子量的目标蛋白(附图2)。(2) Sin蛋白活性分析将以上收获的含目标蛋白的液体经过抽滤除盐后，抑制人脐带静脉细胞增殖试验和抑制鸡胚绒毛血管生成试验(附图3)。证明纯化的Sin蛋白具有抑制新生血管生成的活性。(3) Sin蛋白治疗眼睛血管增生I)制备滴眼液滴眼液I :取Sin蛋白O. 5mg溶解于5ml生理盐水(O. 85 % NaCl)，用孔径为O. I μ m的滤膜过滤除去细菌及病毒，然后加于995ml无菌的生理盐水中制备成滴眼液。
滴眼液2 取Sin蛋白O. 3mg溶解于5ml PBS溶液(每升PBS溶液的制备NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 I. 44g，KH2PO4 0. 24g溶解于800ml蒸馏水中盐酸调pH到7. 4然后加水补充到1000ml，15磅20分高压灭菌冷却至室温)，用孔径为O. I μ m的滤膜过滤除去细菌及病毒，然后加于995ml无菌的PBS溶液中制备成滴眼液。2)滴眼液疗效检测实验一①大鼠视网膜血管增生模型的制作取20只180克SD品系雄性大鼠，注射70毫克/公斤体重的链脲佐菌素，制备大鼠糖尿病模型。当大鼠的患糖尿病达3个月时，进行用药治疗。②滴眼液治疗视网膜血管增生方法将以上制备的视网膜血管增生模型鼠分成两组(A，B)，每组10只。A组鼠的左眼 (AL)滴实例I制备的滴眼液，每只眼睛滴25 μ I/次，每天3次；右眼(AR)滴生理盐水，每只眼睛滴25μ I/次，用药频率同左眼；Β组鼠的左眼(BL)滴实例2制备的滴眼液，每只眼睛滴25 μ I/次，每天3次；右眼(BR)滴生理盐水溶液，每只眼睛滴25 μ I/次，用药频率同左眼。治疗时间为10周。③滴眼液治疗视网膜血管增生的疗效分析将以上20只试验鼠处死，眼球摘除后放入多聚甲醛溶液中。C固定24h，先镜下观察视网膜的血管增生情况(图4)，从图4可见，滴Sin蛋白的左眼的血管数量明显少于滴生理盐水的右眼的血管的数量。然后，组织切片计算视网膜的血管内皮细胞核的数量。每只眼睛观察20个视野，然后计算平均每个视野的内皮细胞核的数量(表I)。结果分析(表 2)表明与负对照组(AR和BR组)比较，试验组的血管内皮细胞核数量呈非常显著性减少(P < O. 01)。表I.用Sin蛋白治疗眼睛血管增生结果血管内皮细胞核数量(个)/平均每个
视野
权利要求
1.一种治疗眼睛血管增生的蛋白质，其特征在于编码这种蛋白质的核苷酸序列是 atggtcagca tcggctacct cctggtgaag cacagccaaa cggaccagga gcccatgtgc 60 ccggtgggca tgaacaaact ctggagtgga tacagcctgc tgtacttcga gggccaggag 120 aaggcgcaca accaggacct ggggctggcg ggctcctgcc tggcgcggtt cagcaccatg 180 cccttcctgt actgcaaccc tggtgatgtc tgctactatg ccagccggaa cgacaagtcc 240 tactggctct ctaccactgc gccgctgccc cttaaggtcg acaagcttgc ggccgcactc 300 gagcaccacc accaccacca ctga324
2.一种治疗眼睛血管增生的蛋白质，其特征在于这种蛋白质的氨基酸序列是Met Val Ser He Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp 151015Gln Glu Pro Met Cys Pro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly 202530Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala His Asn Gln 354045Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met 505560Pro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser 657075Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro 808590Leu Lys Val Asp Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His 95100105His His
3.根据权利要求I所述的一种治疗眼睛血管增生的蛋白质的核苷酸序列和权利要求2 所述的一种治疗眼睛血管增生的蛋白质的氨基酸序列，其特征在于利用所述的核苷酸序列编码的蛋白质制备治疗眼睛血管增生的药物和医药制品。
全文摘要
本发明涉及一种治疗眼睛血管增生的蛋白质的核苷酸序列和氨基酸序列。是人工合成的DNA序列。具体核苷酸序列是序列表中1项下的序列，具体氨基酸序列是序列表中2项下的序列。将这一人工合成的DNA序列重组于毕赤酵母基因组，在毕赤酵母中表达重组蛋白，经过纯化的这种蛋白质能效地抑制人血管内皮细胞增殖，能有效地治疗眼睛血管增生。本发明为生产特效的治疗眼睛血管增生的药物的研究和开发应用创造了必要的条件，具有重要的理论和实际意义。
文档编号A61K38/16GK102584954SQ20111031787
公开日2012年7月18日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者刘振旺, 张泽华, 张添元, 张爱联, 沈锦城, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所, 海南金宝正诚矿业有限公司