专利名称：具有降血压功能的多肽及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有降血压功能的多肽及其用途。
背景技术：
猪血，有着悠久的药用历史，自汉代起，历代本草均把猪血单独列出，记载了它的药用功效“补血养心，熄风镇惊，下气，止血”等等；同时还收录了大量的验方。民间也广泛食用猪血预防、治疗疾病。现代研究亦表明，猪血不仅含有人体所必需的8种氨基酸在内的 18种氨基酸，具有较高的营养价值，还能够治疗贫血、白血病，降低血脂，促进伤口愈合等。 然而现在，人们主要利用了该品种的食用性，很大程度上忽略了它的药用功效。这主要是因为猪血药用功能物质基础不明，对它的药用基础性研究还十分薄弱。国外特别是日本以猪血为原料，研究酶解后的的生物活性肽，多肽的部分功能与本草记载相符。我国猪血资源丰富，年产量约为10亿公斤，但仅有一小部分应用于食品、饲料产业，绝大部分成为废弃物。与我国历史背景类似的日本对猪血的开发利用率为50 60%左右(主要根据本草记载利用现代生物技术进行深度加工后开发为药品)，究其原因主要是国内对该资源重视度不够，有效成分不明确，难以深度利用。国内该资源的丰富性与低水平的利用现状以及本草记载使用的历史与现今国外研究利用的热度，促使我们应该对这一资源引起重视。国外由蛋白质酶解获得的活性肽，是功能性食品、药品开发研究最活跃的领域之一。研究者从食品蛋白质的酶解物中发现了一些小分子肽，这些肽按生理功能主要可分为 吗啡样活性肽、抗高血压肽、免疫调节肽、促进钙吸收的酪蛋白磷酸肽、抗血栓肽、促进DNA 合成和细胞生长的肽、抗菌肽、抗癌肽、促进双歧杆菌生长的肽等。以猪血为蛋白源的生物活性肽是通过现代生物技术酶解后将猪血中的血红蛋白转化为小分子肽。研究表明，小分子猪血肽不仅有很好的溶解性、低粘度，最新研究表明，饮食中的寡肽O 3个氨基酸)和多肽(10 51个氨基酸)能够完整地通过肠道吸收，作为生物活性肽在组织水平上引起机体的生物学效应。而且，蛋白质利用率高，它还具有低抗原性，不会产生过敏反应。1977年Darderme和Pleau等从猪血清中分离和精制了免疫调节激素-胸腺肽 (TF)，并进行了结构分析，得到了其氨基酸，分子量857Da。我国冯启浩等通过药理研究表明，从猪血中得到的TF具有显著的免疫活性。越来越多的研究关注以猪血蛋白为来源的功能性多肽。Kazue Mito等人酶解猪血珠蛋白得到了 4种具有抑制ACE活性的多肽。张艳梅等对猪血中抗菌肽类物质进行分离纯化和抗菌活性研究；王延卓从猪血中分离得到分子量为6kDa的多肽，其对大肠杆菌质控株ATCC25922抗菌活性最好。方俊等对猪血蛋白多肽抗氧化功能进行研究。目前需要在猪血中发现新的活性多肽，以为本领域提供新的选择。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供新的功能多肽。
本发明解决技术问题的技术方案是提供一种新的具有降血压功能的多肽。该具有降血压功能的多肽(1)是具有SEQ ID No. 3所述的氨基酸序列的多肽；或者为(2)是在所述SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列基础上经过取代、缺失、或者添加一个或几个氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。上述多肽的功能为降血压。本发明还提供了上述具有降血压功能的多肽的编码核苷酸序列。本发明还提供了含有上述的编码核苷酸序列的载体。本发明还提供了含有上述载体的宿主细胞。本发明另外也提供了上述具有降血压功能的多肽在制备降血压药物中的用途。当然，本发明也提供了一种新的降血压药物。该降血压药物含有上述的具有降血压功能的多肽作为有效成分。进一步的，上述的降血压药物的剂型为口服制剂。更进一步的，上述的口服制剂主要为胶囊剂、片剂、滴丸、含片、分散片、片剂或颗粒剂等。本发明以猪血为起始的研究材料。首先制得猪血脱色液，然后对猪血脱色液进行进一步的酶解。对酶种类进行比较后，最后仍选用胃蛋白酶进行酶解为佳，通过胃蛋白酶酶解，然后超滤，得到分子量< 3kDa的酶解液MC。随后再将酶解液MC通过凝胶层析分离、反向高效液相色谱法分离、体外ACE抑制活性跟踪得到6个新多肽，Genebank多肽数据库查询表明这6种肽均为首次从猪血中分离得到。并通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-T0F-MS)测定序列，其中一种的氨基酸序列为VVYPW，其对ACE活性抑制的IC5tl为0. 254mg/mL·对VVYPW多肽进行了胃蛋白酶和胰蛋白酶消化实验，被消化后活性增强，说明这种肽能够经口服给药。推测该ACE活性抑制肽为前体型抑制剂(Prodrug-type inhibitor)。药理实验表明，该多肽对自发性高血压大鼠(SHR)有显著的降血压作用。能够在给药后1 36小时内发挥药效，给药后3小时降血压作用最强。初证实了其降血压效该多肽可以作为活性成分再添加本领域的其他辅助性成分，或再添加其他具有抗血压活性的成分制成制剂使用。其剂型最好为口服制剂，如胶囊剂、片剂、滴丸、含片、分散片、口服液、片剂或颗粒剂等常见的口服制剂。本发明首次获得了具有良好降压活性的多肽VVYPW(SEQ ID No 3)，并通过体内外试验证明其合成肽具有良好的降血压作用，能够制备成为降血压药物，并且能够口服使用， 为降血压领域提供了一种新的有效选择，具有很好的市场前景。


图1猪血脱色液SDS-PAGECTris-Glycine体系)电泳图谱。M 标准品1 胃蛋白酶酶解液2 胰蛋白酶酶解液3 :1394蛋白酶酶解液4 木瓜蛋白酶酶解液。图2猪血脱色液SDS-PAGECTris-Tricine体系)电泳图谱。M 标准品1 胃蛋白酶酶解液2 胃蛋白酶酶解液超滤后3 胰蛋白酶酶解液4 胰蛋白酶酶解液分子量超滤后 5 木瓜蛋白酶酶解液6 木瓜蛋白酶酶解液超滤后7 1394蛋白酶酶解液8 :1394蛋白酶酶解液分子量超滤后图3S印hadex G-25凝胶色谱分离图谱。I，II，III，IV，V，VI分别代表组分(管号)1，II，III，IV, V, VI。图4P1、P2、P3的SHRs —次给药血压变化图。SHRs —次给药SBP (收缩压)变化如上所述，垂直条代表标准偏差。其中·代表空白对照组(纯净水)，Δ代表Pl组， 代表Ρ2组，□代表Ρ3组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，ρ < 0. 05。图5Ρ4的SHRs —次给药血压(SBP、收缩压)变化曲线图。其中·代表空白对照组(纯净水)，■代表Ρ4组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，ρ < 0. 05。图6Ρ5的SHRs —次给药血压(SBP、收缩压)变化曲线图。其中▲代表空白对照组(纯净水)，■代表Ρ5组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，ρ < 0. 05。 图7Ρ6的SHRs —次给药血压(SBP、收缩压)变化曲线图。▲代表空白对照组(纯净水)，■代表Ρ6组。纵坐标表示大鼠尾动脉收缩压变化值，横坐标表示给药后时间。与对照组比较，显著度为*，ρ < 0. 05。
具体实施例方式下面结合附图通过实施例对本发明方法作进一步的描述，但并不因此将本发明保护的范围限定在实施例的范围之中。实施例一模拟体内代谢的猪血体外酶解猪血干燥后的主要成分为蛋白质，含量近20%，其中血细胞中的血红蛋白占全血蛋白总量的75%。血红蛋白经水解后，降解成为不同链长的小分子肽类化合物。猪血中显色与腥臭味物质主要为血红素，它对有效物质的提取分离、含量测定、分子量检测等研究严重干扰。猪血的入人体首先被消化酶降解成较稳定的多肽(分子量范围是0. IkDa IOkDa)， 分子量小于3kDa的小肽通常具有生物活性，这类小肽也易被人体吸收。这类小肽也是猪血起效的共性性物质。因此选择合适的方法将猪血脱色成为寻找猪血降压活性成分的首要任务。本发明通过酶解结合活性炭脱色，脱色产物采用消化酶体外模拟体内消化条件， 对脱色液进行进一步的酶解，并对酶解液进行超滤，得到分子量小于3kDa的多肽粗品 (MC)。全过程用Tricine-SDS-PAGE对蛋白、多肽的分子量范围进行跟踪。为进一步分离纯化降压肽奠定基础。1、实验材料与仪器猪血(采集于温江屠宰场)；胃蛋白酶、胰蛋白酶、1394酶、木瓜蛋白酶，德阳生化厂；粉末活性炭(重庆吉元化学有限公司)；五水硫酸铜，无水碳酸钠，柠檬酸三钠，乙酸， 甘油，氢氧化钠，羧甲基淀粉钠，成都市科龙化工试剂厂；福林酚试剂；十二烷基硫酸钠； Acrylamide (丙烯酰胺)，N, N-Methylene bisacrylamide (甲叉双丙烯酰胺),Tris (三羟甲基氨基甲烷)，Tricine(N-三(羟甲基)甲基甘氨酸)，Glycin (甘氨酸)，美国sigma公司；以上皆为分析纯。紫外可见分光光度计(France Anthelie)；冷冻离心机(Biofugo primor) ；pH 计(DD-15)；涡旋混合仪(WH-3)；恒温水浴锅；3kD、IOkD Millipore超滤离心筒；电泳仪 (Mini-proteanlll)；制冰机(SIM-F124)；冷冻离心机(Biofuge primor)；凝胶电泳分析系统(170-8101)2、猪血脱色研究2. 1实验流程新鲜猪血一加入柠檬酸三钠抗凝一离心一取下层一酶解一调pH = 3. O —加吸附剂脱色一离心一取上清液一补足到同一体积一综合评价脱色效果2. 2实验方法2. 2. 1血红素测定用紫外分光光度计对脱色液进行全波长扫描，得到两个最大吸收峰OD28tl和OD415， OD280为蛋白质的特征峰，OD415为血红素的特征峰。本实验选用OD415进行血红素的测定。脱色率按照以下公式计算
脱色率=
AsAs-酶解液脱色前在OD415的吸光度值A0-酶解液脱色后在OD415的吸光度值2. 2. 2蛋白质含量测定采用Iowry法[53]测定脱色液样、猪血原样的蛋白浓度，计算蛋白质得率(PR)。计
算方法如下式
蛋白质得率(PR) = |||||5|xl00O/o
原猪血蛋白浓度2. 2. 3响应值计算脱色效果采用响应值评价，既保证较高的脱色率，又保证较高的蛋白质得率，响应
值越小越好，计算方法如下式
响应值(R)=脱色率Xl00 网χ网2. 2. 4酶活力测定采用中华人民共和国专业标准观)(66030-87《蛋白酶活力测定法》规定的方法。2. 2. 5脱色条件优化采用4因素5水平均勻设计法进行脱色条件优化。2. 3结果分析2. 3. 1脱色剂选择选取粉末活性炭、羧甲基淀粉钠(CMQ、羧甲基纤维素钠(CMC)为脱色剂，评价指标为蛋白质得率、脱色率、响应值、色泽、气味、除去难易(以离心除去时间考察)，考虑脱色剂成本、再生问题。使用胃蛋白酶酶解液，脱色条件为吸附剂加入量4%、pH = 3.0、温度 55°C、反应30min、8000g离心。脱色评价见表1。表1不同脱色剂脱色效果评价
权利要求
1.具有降血压功能的多肽，其特征在于(1)是具有SEQID No. 3所述的氨基酸序列的多肽； 或者为(2)是在所述SEQID No. 3所示的氨基酸序列基础上经过取代、缺失、或者添加一个或几个氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。
2.权利要求1所述的具有降血压功能的多肽的编码核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述的编码核苷酸序列的载体。
4.含有权利要求3所述的载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述的具有降血压功能的多肽在制备降血压药物中的用途。
6.降血压药物，其特征在于含有权利要求1所述的具有降血压功能的多肽作为有效成分。
7.根据权利要求6所述的降血压药物，其特征在于为口服制剂。
8.根据权利要求7所述的降血压药物，其特征在于所述的口服制剂为胶囊剂、片剂、 滴丸、含片、口服液、分散片、片剂或颗粒剂。
全文摘要
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种具有降血压功能的多肽及其用途。本发明所要解决的技术问题是提供新的降血压多肽。本发明解决技术问题的技术方案是提供一种降血压多肽。该具有降血压功能的多肽(1)是具有SEQ ID No.3所述的氨基酸序列的多肽；或者为(2)是在所述SEQ ID No.3所示的氨基酸序列基础上经过取代、缺失、或者添加一个或几个氨基酸后且具有相同或相似功能的多肽。通过体内外试验证明该多肽其具有良好的降血压作用，能够制备成为降血压药物，为降血压领域提供了一种新的有效选择。
文档编号A61P9/12GK102276695SQ201110223589
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月5日 优先权日2011年8月5日
发明者万德光, 任艳, 国锦琳 申请人:成都中医药大学