专利名称：壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料的制备方法
技术领域：
本发明属于材料技术领域，具体涉及一种多孔支架材料的制备方法。
背景技术：
细胞外基质(Extra Cellular Matrix, ECM)在组织再生中起着重要的作用，它不仅具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用，对细胞的基本生命活动也发挥全方位的生物学作用，它影响细胞的存活、生长与死亡，决定细胞的形状，控制细胞的分化，参与细胞的迁移等等，因此制备支架的主要目标就是在暂时的三维空间中模拟自然ECM的功能， 使支架能够引导每一个细胞反应，包括细胞黏附、移动、分裂到表型选择等。组织工程支架材料的选择和制备是组织工程技术是否运用成功的关键。除了考虑材料的化学性质外，材料的物理性质如孔隙率、机械强度、孔之间的连通性以及用于细胞粘附的表面积等也起着重要的作用。组织工程用支架需要较高的孔隙率，且孔径和支架的结构在组织的培养中也起着关键的作用。致孔剂是形成孔径大小、材料内部结构的决定因素，致孔剂相互粘结，是保证三维支架孔隙相互连通的基础，也是实现高孔隙率的主要途径。Murphy等利用NaCl的吸潮性， 预先将作为致孔剂的NaCl粘结、干燥成型，再通过溶液浇注-颗粒浙析技术，制备出孔隙间相互连通、其孔隙间通道的尺寸由粘结条件控制的多孔三维细胞支架，但NaCl吸潮的过程中其粒径、形态会发生改变，致使所形成的多孔支架孔隙大小不一，形状不规则。Ma等人利用石蜡软化融结性质，将石蜡微球粘结成型，浇注聚乳酸的吡啶溶液后，用环(正)己烷浸取石蜡，获得孔隙形态为球形，孔隙间相互连通、且通道尺寸可控的三维支架。但是，石蜡软化融结的过程中会破坏石蜡微球的球形结构，致使所形成的支架材料孔隙不规则，需要使用吡啶为溶剂且难以保证石蜡完全从支架中去除。曹谊林等人将粘结剂与离心技术结合， 探索和研究了控制大体积致孔剂粘结程度的新方法(称为离心粘结技术)，制备出了粘结程度可控、结构均勻的大体积致孔剂粘结块，并得到内部结构可控的大体积三维细胞支架。 但是粘结剂的大量加入和残留可能会对支架的性能产生一定的影响。You N. X.以自制射流装置制备聚己内酯微球，弧形凹槽将微球密堆积，但其需在真空下操作，增加了实验的难度。Tetsuo A.利用挤压法对无定形NaCl和蔗糖进行密堆积排列，方法简单，容易操作，密堆积效果好，但是由于采用NaCl和蔗糖为致孔剂，为了实现致孔剂最大程度的密堆积，需要施加很大的挤压力，这就会导致部分粒径均一的致孔剂碎裂，浙滤后所形成的支架材料孔隙不规则，孔径不均一。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述制备方法的缺点，提供一种操作简单， 孔径均一、孔隙规则、孔隙率高的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法。解决上述技术问题所采用的技术方案是1、溶解壳聚糖和羟基磷灰石
以20g/L的乙酸水溶液为溶剂溶解壳聚糖、羟基磷灰石，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1 0.05 0.3，搅拌4 8小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液。2、制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料以SiO2微球为致孔剂，将SiO2微球加入带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 125 0. 25，加入步骤1得到的壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为S^2微球体积的0. 5 1，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiO2微球，将注射器置于真空干燥箱中干燥，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2 4小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-5 -50°C预冻12 M小时，冷冻干燥，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，SiO2微球的粒径为100 150 μ m。上述的SiA 微球(Spherical 140SL-II-PREP)由日本半井公司(NACALAI TESQUE, INC, KYOTO, TAPAN)生产，再经80目和100目标准筛筛分。本发明的溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤1中，优选壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1 0.1 0.2，最佳选择壳聚糖与羟基磷灰石按质量比为1 0.2。本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维复合多孔支架材料步骤2中，SiO2微球的加入量最佳为注射器容积的0. 25，壳聚糖与羟基磷灰石的混合液的加入量与SiO2微球的体积相同。本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，最佳将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时。本发明的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，最佳选择在冰箱中-20°C预冻M小时。本发明以溶剂浇注-粒子浙滤技术为基础，结合挤压法，采用粒径均一、表面多孔的高纯度S^2微球为致孔剂，可通过改变S^2微球的尺寸来调节多孔支架材料的孔隙大小，制备出不同孔径的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架。与传统的使用粘结剂将致孔剂密堆积排列的方法相比，本发明方法简单，操作方便，致孔剂密堆积效果好，制备出的多孔支架无粘结剂残留，通透性好，孔径均一，孔隙率最高可达到90. 94%、压缩强度为 818kPa，远高于纯壳聚糖多孔支架。试验结果表明，该支架具有良好的体外和体内生物相容性。


图1是实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架的扫描电镜图。图2是实施例2制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架的扫描电镜图。图3是空白组术后7天肌肉组织HE染色图。
图4是空白组术后14天肌肉组织HE染色图。图5是空白组术后28天肌肉组织HE染色图。图6是试验组术后7天植入部位临近肌肉组织HE染色图。
图7是试验组术后14天植入部位临近肌肉组织HE染色图。图8是试验组术后21天植入部位临近肌肉组织HE染色图。图9是空白组术后7天撕裂肌肉组织的HE染色图。图10是空白组术后14天撕裂肌肉组织的HE染色图。图11是空白组术后21天撕裂肌肉组织的HE染色图。图12是试验组术后7天植入部位撕裂肌肉组织的HE染色图。图13是试验组术后14天植入部位撕裂肌肉组织的HE染色图。图14是试验组术后21天植入部位撕裂肌肉组织的HE染色图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例11、溶解壳聚糖和羟基磷灰石将Ig壳聚糖(脱乙酰度为80% 95% )、0· Ig羟基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L 的乙酸水溶液中，搅拌6小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液。2、制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料以SW2微球为致孔剂，将粒径为100 150 μ m的SW2微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SiO2微球，直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 25，再向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量与SiA微球的体积相同，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiA微球，将注射器置于真空干燥箱中60°C干燥M小时，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时， 用水冲洗至中性，在冰箱中-20°C预冻12 M小时，用液氮预冻30分钟，-50°C冷冻干燥 24小时，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。所制备的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料采用QUanta200环境扫描电子显微镜进行形貌表征，结果见图1，并按照下述方法测试支架材料的孔隙率和压缩强度将比重瓶装满乙醇称重巧；将重Ws的样品浸入乙醇中，真空脱气，乙醇充盈于多孔支架中，再加满乙醇称重W2 ；取出浸满乙醇的样品，剩余的乙醇与比重瓶称重w3。按下式计算支架孔隙率ε ε = Vp/ (Vp+Vs) = (W2-W3-Ws) / (W1-W3)将支架材料制成直径为12mm、高IOmm的圆柱体试样，在温度为25°C，采用动态粘弹谱仪按照GB/T1041-1992，以IN/分钟的变化速率在1 13N斜坡力的作用下，测其应变为25%的应力值。在测试过程中，试样在变形小于25%之前断裂，断裂强度即为压缩强度； 试样在变形25%还没有断裂，变形25%时的强度即为压缩强度。每组取5个样品，取测试结果的平均值。实验结果表明，该复合多孔支架的孔是开放的，孔与孔之间连通性较好，孔隙呈规则的圆孔，平均孔径为125 μ m，孔隙率为90. 94%，压缩强度为794kPa。实施例2在实施例1的配制壳聚糖/羟基磷灰石混合液步骤1中，将Ig壳聚糖(脱乙酰度为80% 95% )、0. 2g羟基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌6小时，离心去气泡。其他步骤与实施例1相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料。按照试验1的方法进行形貌表征和孔隙率、压缩强度测试，实验结果表明该复合多孔支架的孔是开放的，孔与孔之间连通性较好，平均孔径为117 μ m(见图2)，孔隙率为 91. 97%，压缩强度为818kPa。实施例3本实施例的溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤1中，将Ig壳聚糖(脱乙酰度为80 % 95% )、0. 05g羟基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌4小时，离心去气泡。 其他步骤与实施例1相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料。实施例4本实施例的溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤1中，将Ig壳聚糖(脱乙酰度为80 % 95% )、0. 3g羟基磷灰石溶解于IOOmL 20g/L的乙酸水溶液中，搅拌8小时，离心去气泡。其他步骤与实施例1相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔支架材料。实施例5在实施例1 4的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将粒径为100 150 μ m的SiA微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SW2微球， 直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 125，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。实施例6在实施例1 4的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将粒径为100 150 μ m的SiA微球加入20mL带针头的注射器中，用杵挤压、夯实SW2微球， 直至其在注射器中的位置不发生改变为止，SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 2，该步骤的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。实施例7在实施例1 6的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为SiO2微球体积的0. 5，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。实施例8在实施例1 6的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，向注射器中加入壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为S^2微球体积的0. 75，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。实施例9在实施例1 8的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2小时，用水冲洗至中性， 在冰箱中_5°C预冻M小时，用液氮预冻30分钟，_50°C冷冻干燥M小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。实施例10在实施例1 8的制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤2中，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸4小时，用水冲洗至中性， 在冰箱中_50°C预冻12小时，用液氮预冻30分钟，-50°C冷冻干燥M小时，该步骤的其他步骤与相应实施例相同。其他步骤与相应实施例相同，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。为了证明本发明的有益效果，发明人对本发明实施例1和实施例2制备的壳聚糖 /羟基磷灰石三维多孔支架材料进行了各种实验室研究试验，各种试验情况如下实验材料第3代骨肉瘤细胞购于中国典型培养物保藏中心(武汉)；健康雄性 SD大鼠，体重200 220g，购于西安交通大学医学院实验动物中心(西安)；Dulbecco’ s Modified Eagle Medium(DMEM)细胞培养液、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜，购于美国 Sigma-Aldrich公司；白细胞介素1 β试剂盒、白细胞介素6试剂盒、白细胞介素10试剂盒、 肿瘤坏死因子TNF-α试剂盒，由美国R&D公司生产。实验仪器=Zenyth 3100酶标仪，由奥地利Anthos公司生产；Q800DMA动态粘弹谱仪、由美国TA公司生产；RM2U6组织切片机由德国LEICA公司生产。1、多孔支架的体外活性实验将直径为14mm、厚度为2mm的截面片状支架用6tlCo辐照消毒后，用含10%胎牛血清的DMEM培养液浸湿，然后置于M孔板内，每孔1片支架；将第3代骨肉瘤细胞加入含 10%胎牛血清的DMEM培养液中，得到细胞浓度为3X IO8个/L的细胞悬液，每片支架上均勻滴加100 μ L细胞悬液，静置4小时后再沿孔壁缓慢加入含10%胎牛血清的DMEM培养液， 每孔加1. 5mL ；将M孔板置于37°C、5% C02、95%相对湿度的(X)2培养箱中培养。实验分为受试材料组、阴性对照组(空白组)、阳性对照组(含0. 64%苯酚的DMEM 培养液)。将受试材料组(实施例1制备的壳聚糖/羟基磷灰石多孔支架材料)分别在(X)2 培养箱中培养M、48、72小时(分别做三组平行实验)，吸弃培养基，用PBS缓冲溶液清洗受试材料3次，置于新的培养板中，每孔1片支架，每孔加入ImL DMEM细胞培养液和40 μ L 5mg/mL的MTT水溶液，37°C孵育4小时，吸弃上清液，每孔加入420 μ L 二甲基亚砜，振荡10 分钟，每孔吸取150 μ L至96孔板，用酶联免疫检测仪检测其在490nm波长处的吸光度值 OD (测得的吸光度值OD与细胞增殖数成正比)，每个时间点每组平行测定5孔计算均数和标准差。按下式计算相对增殖率RGR并评价材料的细胞毒性RGR = 0Dtest/0Dcontast X 100%式中RGR为细胞毒性实验相对增殖率(％ ) ；ODtest为试验组吸光值；0D。。ntast为阴性对照组吸光值。表1是不同的RGR所对应的细胞毒性等级。表1相对增值率与细胞毒性分级的关系
权利要求
1.一种壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于由下述步骤组成(1)溶解壳聚糖和羟基磷灰石以20g/L的乙酸水溶液为溶剂溶解壳聚糖、羟基磷灰石，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为1 0.05 0.3，搅拌4 8小时，离心去气泡，得到壳聚糖与羟基磷灰石的混合液；(2)制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料以SiO2微球为致孔剂，将S^2微球加入带针头的注射器中，用杵挤压、夯实S^2微球， SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 125 0. 25，加入步骤(1)得到的壳聚糖与羟基磷灰石的混合液，混合液的加入量为SiO2微球体积的0. 5 1，推动注射器的活塞柄，使混合液流过紧密排列的SiO2微球，将注射器置于真空干燥箱中干燥，从注射器中取出粘结块，用刀切去粘结块上、下表面层，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸2 4小时，用水冲洗至中性，在冰箱中-5 -50°C预冻12 M小时，冷冻干燥，制备成壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于所述的SW2微球的粒径为100 150 μ m。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法， 其特征在于在溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤(1)中，壳聚糖与羟基磷灰石的质量比为 1 0. 1 0. 2。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法， 其特征在于在溶解壳聚糖和羟基磷灰石步骤(1)中，壳聚糖与羟基磷灰石按质量比为 1 0. 2。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于在制备壳聚糖/羟基磷灰石三维复合多孔支架材料步骤( 中，SiO2微球的加入量为注射器容积的0. 25，壳聚糖与羟基磷灰石的混合液的加入量与SiA微球的体积相同。
6.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于在制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤O)中，将切去上、下表面层的粘结块置于0. 05g/mL的NaOH水溶液中煮沸3小时。
7.根据权利要求1所述的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，其特征在于在制备壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料步骤( 中，所述的预冻是在冰箱中-20°C预冻M小时。
全文摘要
一种壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法，以溶剂浇注-粒子沥滤技术为基础，结合挤压法，采用粒径均一、表面多孔的高纯度SiO2微球为致孔剂，可通过改变SiO2微球的尺寸来调节多孔支架材料的孔隙大小，制备出不同孔径的壳聚糖/羟基磷灰石三维多孔复合支架。与传统的使用粘结剂将致孔剂密堆积排列的方法相比，本发明方法简单，操作方便，致孔剂密堆积效果好，制备出的多孔支架无粘结剂残留，通透性好，孔径均一，孔隙率和压缩强度高于纯壳聚糖多孔支架。试验结果表明，该支架具有良好的体外和体内生物相容性。
文档编号A61L27/20GK102266590SQ20111019955
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者张志琪, 牟朝丽, 王金磊, 祁小妮 申请人:陕西师范大学