专利名称：肠道病毒71型感染7日龄c57/bl6小鼠模型的建立方法
技术领域：
本发明涉及一种肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法。
背景技术：
肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属，是手足口病(HFMD)的主要病原(Hand Foot and Mouth Disease, HFMD)。自2008年以来我国多次发生EV71的暴发感染，时有病死发生，已经成为备受关注的公共卫生问题。目前其感染和致病机制、病毒结构特征及毒力相关基因等还不明确，并且临床缺乏有效的药物和疫苗。因此深刻理解病毒生物学特性与宿主感染的相互关系，疫苗设计研发及药物筛选研究意义重大。由于EV71病毒具有严格的宿主特异性，目前国内尚未建立稳定的动物感染模型。 这一现状从根本上制约了 EV71临床基础研究和临床防治策略的制定，导致临床高效特异的治疗药物和预防性疫苗的缺乏。因此，建立稳定的动物感染模型成为EV71研究和防治的关键问题。

发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法，动物模型的建立可促进对肠道病毒71型致病机制和宿主免疫机制的研究， 并可用于高效抗病毒药物的筛选和疫苗评价，为EV71病原学研究、临床治疗研究以及疫苗学研究解决了关键性难题。本发明是通过以下技术方案实现的一种肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法，包括以下步骤取 7日龄C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量为20 μ L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 μ L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% CO2培养，每天观察细胞病变情况，至MA104细胞70%出现凝集、皱缩时，将整瓶细胞冻融，离心取上清，即得到EV71的病毒液。所述EV71毒种，为现有技术中已有的，常规取得即可，本发明对此无限制，不再赘述。所述建立方法，还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的小鼠，5天后，后肢出现反应迟缓、后肢瘫痪，7天后死亡的，即为感染成功的小鼠模型。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型感染的小鼠模型，其后肢瘫痪率一般为70% 100%，死亡率为30 100%。本发明为科研人员研究肠道病毒71型病原学、肠道病毒71型致病机制以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广阔的应用前景。


图1为临床分离毒株的RT-PCR鉴定的电泳图，其中，M = Maker (D2000)，N=阴性细胞对照，B =空白试剂对照，1 =分离毒株。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1建立感染肠道病毒71型的7日龄C57/BL6小鼠模型步骤如下1、EV71的分离鉴定本发明所采用的EV71毒株是从临床的重症手足口病人的粪便标本中分离的，同时采用人横纹肌肉瘤细胞株(RD)、恒河猴肾细胞株(MA104)和非洲绿猴肾细胞株(Vero)三种细胞对标本中的病毒进行分离，结果三种细胞上菌出现了细胞病变，传代后冻存毒种。然后提取分离到的EV71的基因组RNA，逆转录成cDNA，采用EV71国家标准引物对分离毒株进行鉴定，结果表明分离毒株在226bp处出现了很亮的条带(如图1所示)，可证实从临床手足口重症病人粪便标本中分离的毒株为EV71。2、EV71感染动物模型的建立2.1小鼠的准备购买SPF级别的C57/BL6乳鼠2组(带母鼠)，每组6只，25°C、湿度50%，分格饲养在ABSL-2实验室的净化动物饲养柜内，每天观察动物生长情况，C57/BL6乳鼠生长状态良好。2. 2毒种的准备将分离的EV71毒种，以200yL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞， 37°C、5% CO2培养，每天观察细胞病变情况。接种EV71后第2天，MA104细胞约70%出现了凝集、皱缩，将整瓶细胞冻融后，离心取上清，即得到EV71的病毒液。2. 3EV71感染动物模型的建立2. 3. 1动物分组将两组动物分别设为病毒组和正常对照组，病毒组肌注接种EV71病毒，正常对照组左后肢肌注接种含2%胎牛血清的1640培养液。2. 3. 2 接种 EV71采用无菌的微量进样器，病毒组每只C57/BL6小鼠左后肢肌肉注射病毒液20 μ L， 正常对照组每只C57/BL6小鼠左后肢肌肉注射含2%胎牛血清的1640培养液20 μ L。然后将动物按相同的条件饲养在净化动物饲养柜内，每天观察动物。2. 3. 3接毒后的观察接种0天至4天病毒组和正常对照组均无异常；接种5天后病毒组动物后肢全部出现明显后肢瘫痪，正常对照组无异常，取两组动物各3只分别进行解剖固定；至接种7天病毒组剩余乳鼠均死亡，正常对照组无异常，动物模型建立成功。
权利要求
1.一种肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤取7日龄C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于所述病毒液注射量为20 μ L，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以 200 μ L/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37°C,5% CO2培养，每天观察细胞病变情况，至MA104细胞70%出现凝集、皱缩时，将整瓶细胞冻融，离心取上清，即得到EV71的病毒液。
3.根据权利要求1所述的肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法，其特征在于还包括以下小鼠模型的鉴定步骤饲养上述接种肠道病毒71型的乳鼠，5天后， 后肢出现反应迟缓、后肢瘫痪，7天后死亡的，即为感染成功的乳鼠模型。
全文摘要
本发明公开了一种肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型的建立方法取7日龄C57/BL6小鼠，后肢肌肉注射病毒液，即得肠道病毒71型感染的小鼠模型。所述病毒液注射量为20μL，是通过以下方法制得的将EV71毒种，以200μL/100mL细胞培养瓶的接种量接种MA104细胞，37℃、5％CO2培养，每天观察细胞病变情况，至MA104细胞有70％出现凝集、皱缩时，将整瓶细胞冻融，离心取上清，即得到EV71的病毒液。本发明成功地建立了稳定的肠道病毒71型感染7日龄C57/BL6小鼠模型，为肠道病毒71型生物学特性研究、致病机制及宿主免疫应答机制研究以及高效抗病毒药物的筛选和疫苗的研制提供了基础，具有广阔的应用前景。
文档编号A61K35/76GK102441011SQ20111032799
公开日2012年5月9日 申请日期2011年10月25日 优先权日2011年10月25日
发明者姜国胜, 孟红, 宋楠楠, 岳盈盈, 李志会, 李鹏 申请人:山东省医学科学院基础医学研究所