专利名称：人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，特别是涉及到一种人α B-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用及药物。
背景技术：
视神经损伤是临床常见眼外伤类型和致盲原因。近年，随着社会经济发展，交通事故等外伤的增多，视神经损伤也明显增多，在颅脑外伤患者中其发生率为6% 12.6%。传统的观点认为视神经损伤后发生不可逆的病理改变，神经组织不能再生，视功能损伤不能恢复。目前，尚无确切有效的治疗手段。因此在视神经损伤后，及时采取有效的治疗方法，保护和挽救视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells, RGCs)的存活和促进其轴突修复， 已成为目前研究的热点。视神经损伤后难以再生的主要原因有损伤后视网膜神经节细胞(retinal ganglion cellsRGCs)的继发性凋亡；失去靶细胞提供的营养物质；损伤局部胶质瘢痕的形成以及抑制性微环境的阻碍作用。为此，以往促进视神经再生研究主要集中在1)补充外源性神经营养因子。虽可一定程度保护RGCs存活，但作用短暂，多无促再生作用；2)干扰凋亡信号通路可减少RGCs发生凋亡，但并不能增强其轴突再生能力；3)用抗体或核酸干扰阻断髓鞘抑制物的作用能促进RGCs轴突再生，但也只是短距离再生。此外，外周神经移植可促进视神经再生，但未能实现再生纤维与视中枢形成功能联接。由此可见，目前的各种方法均不能达到神经纤维长距离有效的功能性再生。α B-晶体蛋白是α -晶体蛋白的一个亚基，Srivastava于2002年首次从晶 ^^1 ^(Srivastava OP, Srivastava K. Existence of deamidated
alphaB-crystal1 in fragm ents innormal and cataractous human lenses[J]. Mol Vis. 2003,9 :110-118.)。α B-晶体蛋白是小分子热休克蛋白家族中的sHspB5，因此其具有小分子热休克蛋白家族的共性，分子量小，大小约20KD，参与细胞的发育过程，并抵御多种因素引起的应激损伤和凋亡。不仅可以对变性神经组织有保护和促进修复作用， 还具有抑制炎症、应激反应，维护细胞骨架蛋白和骨架网络稳定性，及抵抗缺氧、高温、反射线及药物等因素诱导的细胞凋亡的作用。国内外的研究结果也显示，αΒ-晶体蛋白与眼科青光眼视神经病变、视网膜撕裂、年龄相关性黄斑变性、视网膜缺血再灌注损伤， 视网膜营养不良、糖尿病视网膜病变等多种病变有关。而且，重组αΒ-晶体蛋白用于多发性硬化的治疗，已在动物实验中取得了良好的治疗效果(Ousman SS, Tomooka BH, vanNoort JM et al. Protective and therapeutic role for alphaB-crystal1 in in autoimmunedemyelination[J], Nature. 2007,448(7152) :474-479)。近来研究发现既不在玻璃体腔注射神经营养因子，也不需髓鞘抑制物的中和抗体，晶状体损伤后能显著促进 RGCs的存活及轴突再生，并且再生轴突可达到上丘，形成功能性突触联系，这一保护作用显著强于已知神经营养因子及中和髓鞘抑制物的作用，但尚不明确这种保护作用的机理及起保护作用的活性物质是什么。

发明内容
本发明根据上述领域的空白，提供一种保护视网膜神经节细胞的药物。人α B-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用。所述保护视网膜神经节细胞的药物，其特征在于其有效成分为分离纯化的重组人α B-晶体蛋白，所述重组人α B-晶体蛋白的氨基酸序列如kq ID No. 1所示。所述药物的剂型为注射剂。所述药物的制备方法将分离纯化的重组人α B-晶体蛋白溶于不影响α Β_晶体蛋白活性且适用于人体注射的溶剂中。所述溶剂的配方为20mM Tris-HCl, pH 7. 5，50mM氯化钠，ImM EDTA，溶于无菌水中。所述重组人α B"晶体蛋白是人工构建的包含有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列的重组表达载体在体外表达，然后经分离纯化而得的重组蛋白。所述体外表达指将所述重组表达载体pET28a_a B-crystallin转染到BL21细胞中，诱导阳性BL21细胞表达重组人aB-晶体蛋白。本发明基于发明人的发现人源a B晶体蛋白是晶体源性神经保护物质并能与视网膜神经节细胞胞膜结合，而且能拮抗髓鞘抑制物的阻碍作用促进RGCs突起的生长。发明人通过一序列动物模型试验证明重组人a B-晶体蛋白在视神经损伤后对RCGs有明显的保护作用，能够明显提高RGCs的存活率，促进RGCs突起的生长和受损的视神经轴突再生。根据这一系列试验结果，本发明提出了重组人a B晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用。这类药物以人工表达的重组人aB晶体蛋白为有效成分，能够对视网膜神经细胞的损伤提供有效的保护和恢复作用，促进视网膜神经节细胞细胞突起的生长和轴突再生。本发明的药物，主要制备成注射剂，经静脉给药，注射剂的溶剂须是不影响a B-晶体蛋白活性，并适合人体注射两个条件。人aB-晶体蛋白为已知蛋白，本领域技术人员基于对a B-晶体蛋白活性及保存条件的了解，可配制多种溶剂对有效成分重组人 a B-晶体蛋白进行溶解制备成本发明的药物注射剂。本发明还提供了药物的制备方法，主要步骤是体外制备重组人a B-晶体蛋白，然后溶于溶剂中。体外制备重组人aB-晶体蛋白，包括构建重组表达载体，转染体外宿主细胞，培育细胞使其表达重组蛋白等步骤，aB-晶体蛋白可依照现有技术 (Ousman SS, Tomooka BH, vanNoort JM et al. Protective and therapeutic role for alphaB-crystallin in autoimmunedemyelination[J]. Nature. 2007,448(7152) 474-479)来操作。


图1-1PCR扩增产物电泳图，1 泳道DL2000DNA marker, 2 泳道PCR 产物图 1-2 PMD19-T-α B-crystallin 酶切鉴定电泳图，1 泳道:DNA ladder marker, 2 泳道:PMD 19_Τ_ α B-crystallin 酶切条带
图 1-3 pET32a- α B-crystal 1 in 酶切鉴定电泳图，1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道pET32a_ α B-crystalIin 酶切条带图1-6PCR扩增产物电泳图1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道PCR 产物图 1-7 pET28a- α B-crystal 1 in 酶切鉴定电泳图1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道pEI^8a_ α B-crystalIin 酶切条带图 1-8 pET28a- α B-crystal Iin 质粒测序图1-9重组蛋白SDS-PAGE分析1泳道蛋白分子量marker2-4泳道0. 4mM和0. 6mM浓度的IPTG下诱导的上清和沉淀图1-10 (a)重组α B-晶体蛋白Q柱纯化1-10 (b)层析过程中的α B-晶体蛋白SDS-PAGE1-3泳道上样样品、穿透、沉淀，4泳道蛋白分子量marker，5-9泳道纯化过程中pl、p2、p3、p4、p5分别收集的纯化蛋白图1-11重组蛋白考马斯亮蓝染色1泳道蛋白分子量marker2泳道重组人aB-晶体蛋白；图1-13重组人α Β_晶体蛋白肽质量指纹质谱鉴定蛋白评分图1-14重组人α Β_晶体蛋白肽质量指纹质谱鉴定结果图2-1实验用Long Evans大鼠图2-2实验用中号无创血管钳图2-3大鼠尾静脉注射图2-4大鼠上丘和外侧膝状体定位图2-5大鼠视网膜铺片RGCs计数示意2-7正常组大鼠视网膜荧光金逆行标记的RGCs荧光金标记的正常RGCs细胞形态呈三角形(b图粗箭头)或圆形(b图细箭头)， 胞浆荧光均勻明亮。&(\100倍)，13(\400倍)图2-8视神经损伤后2周，各组视网膜荧光金标记的RGCsa(l) :C 组(X200 倍):C 组(X400 倍)b(l) :S 组(X200 倍)；b(2) :S 组(X400 倍)图2-9视神经损伤后4周，各组视网膜荧光金标记的RGCsa(l) :C 组(X200 倍):C 组(X400 倍)b(l) :S 组(X200 倍)；b(2) :S 组(X400 倍)
图2-11正常大鼠β -IΙΙ-tubulin免疫荧光染色a(X200 倍)，b(X400 倍)图2-12视神经钳夹伤2周后，大鼠β -ΙΙΙ-tubulin免疫荧光染色a(l) :C 组(X 100 倍):C 组(X400 倍)b(l) :S 组(X 100 倍)；b(2) :S 组(X400 倍)图2-13视神经损伤后4周，各组β ΙΙΙ-tubulin免疫荧光染色的RGCs
a(l) :C 组(X200 倍):C 组(X400 倍)b(l) :S 组(X200 倍)；b(2) :S 组(X400 倍)
具体实施例方式实施例1.人α B-晶体蛋白的制备一、质粒、菌株和细胞1.大肠杆菌 BL21(DE3)2. PMD19-T 载体(TAKARA 公司，日本)3. DH5 α 菌株、pET32a 质粒、pET28a 质粒(Novagen 公司，美国)二、主要酶和试剂1.逆转录试剂盒((Τ0Υ0Β0公司，日本)2. Luria-Bertani medium(Difco 公司，美国)3. KOD Plus DNA Polymerase (Τ0Υ0Β0 公司，日本)4.限制性内切酶 Nco、HindIII、EcoRI、XhoI (Τ0Υ0Β0 公司，日本)5. DNA 连接酶 solution I (TAKARA 公司，日本)6.多聚酶链反应(PCR)试剂Taq聚合酶(TAKARA公司，日本)
7. dNTPs (TAKARA 公司，日本)8. DNA marker (北京天根公司，中国)9. IPTG (Sigma 公司，美国)10. Trx and Trx antibody (R&D 公司，美国)13. a-crystalIin (Sigma 公司，美国)14. aB-crystallin antibody (&inta 公司，美国)15. Primers (Sangon ^W], ψ H )16. aB-crystallin (Cell Sciences)17. Tris碱(TBD生物技术发展中心，中国)18.甘氨酸(绿鸟科技发展有限公司，中国)19. SDS (TBD生物技术发展中心，中国)20.预染标准蛋白质marker (中山生物技术有限公司，中国)22.辣根酶标记的抗兔IgG(中山生物技术有限公司，中国)23.化学发光显影剂(Pierce公司，美国)M.BCA法蛋白定量试剂盒(百泰克生物技术有限公司，中国)25.碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG(中山生物技术有限公司，中国)三、主要仪器1.超净工作台(苏州集团安泰公司，中国)2.转膜仪(杭州博日科技有限公司，中国)3·图像分析仪(Leica公司，德国)
4.凝胶成像系统(BIV-RAD公司，美国)5.自动凝胶层析仪(MB99-2)(沪西分析仪器厂，中国)6.紫外可见分光光度计(Tu-1900)(北京普析通用仪器有限责任公司，中国)
四、主要配方Sterile filtered liquid in 20mM Tris-HCl, pH 7. 5+50mM NaCl+lmM EDTA1.磷酸缓冲液的配制(0. 05mol/L, pH6. 7)称磷酸氢二钠7. 7895g，磷酸二氢钠 4. 407g溶于双蒸水中，定容至1L，过滤去除杂质。2.电泳缓冲液的配制(5X) :Tris碱15. lg，SDS 5g，甘氨酸94g，加双蒸水至 IOOOml 定容。3. 12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺电泳-分离胶的配制30%丙烯酰胺溶液 4. 0ml，10 % SDS 0. lml，10 % 过硫酸胺 0. lml，1. 5mmol/L Tris 2. 5ml (pH8. 8)，TEMED 0. 004ml，双蒸水 3. 3ml，共 10ml。4.5% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺电泳-积层胶的配制30%丙烯酰胺溶液 0. 83ml, 10% SDS 0. 05ml, 10%过硫酸胺 0. 05ml, 1. Ommo 1/L Tris 0. 63ml (pH 6. 8)，TEMED 0. 005ml，双蒸水 3. 4ml，共 5ml。5. 10%过硫酸胺的配制过硫酸胺lg，加双蒸水至IOml定容。6.上样缓冲液的配制(2X)双蒸水 5ml，0. lmol/L Tris-HCl (pH 6. 8)5ml,4% (w/v) SDS20ml,20% (v/v)甘油 10ml, 0. 2mol/L 2_b_ 巯基乙醇 0. 25g，0. 2% (w/v)溴酚蓝 0. 08g。7.转膜缓冲液甲醇 200ml，甘氨酸 2. 9g，SDSO. 37g，Tris5. 8g，双蒸水 1000ml。8. TBST 缓冲液(PH7. 5) :Tween200. 5ml, NaC18. 76g, Tris6. 05g，双蒸水 1000ml。五、实验方法(一)人αB-晶体蛋白基因获得在GenBank中检索到人α B-晶体蛋白的序列为Seq ID NO. 1所示。根据大肠杆菌的密码子使用偏好，将人α B-crystallin的氨基酸序列转化DNA序列，人工合成cDNA序列。(二)目的基因的PCR扩增根据人α B-晶体蛋白的基因序列及pET3h载体的多克隆位点，采用I^rimer 5. 0 软件设计扩增人α B-晶体蛋白基因的特异性引物。上游引物序列为5' -GGAATTGATCG CCATCCACCAC-3‘，下游引物序列为5' -CCGCTCGAGCTATTTCTTGGGGGCTGC GG-3‘。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增片段长度为Μ^ρ。1、变性反应体系为
权利要求
1.人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用。
2.保护视网膜神经节细胞的药物，其特征在于其有效成分为分离纯化的重组人 α B-晶体蛋白，所述重组人α B-晶体蛋白的氨基酸序列如kq ID No. 1所示。
3.根据权利要求1所述的药物，剂型为注射剂。
4.根据权利要求3所述的药物，所述注射剂所用的溶剂，pH7.5，配方为20!111 Tris-HCl、50mM 氯化钠、ImMEDTA、无菌水。
5.根据权利要求3所述的药物，所述重组人αΒ-晶体蛋白是人工构建的包含有如％(1 IDNo. 2所示的核苷酸序列的重组表达载体在体外表达，然后经分离纯化而得的重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的药物，所述体外表达指将重组表达载体 pET28a-aB-crystallin转染到BL21细胞中，诱导阳性BL21细胞表达重组人α B-晶体蛋白。
7.权利要求1 7任一所述的药物的制备方法将分离纯化的重组人αB-晶体蛋白溶于不影响α B-晶体蛋白活性且适用于人体注射的溶剂中。
8.根据权利要求7所述的制备方法，所述重组人αB-晶体蛋白是人工构建的包含有如 Seq IDNo. 2所示的核苷酸序列的重组表达载体在体外表达，然后经分离纯化而得的重组蛋白。
9.根据权利要求8所述的制备方法，所述体外表达指将所述重组表达载体 pET28a-aB-crystallin转染到BL21细胞中，诱导阳性BL21细胞表达重组人α B-晶体蛋白。
全文摘要
本发明“人αB-晶体蛋白在制备保护视网膜神经节细胞的药物中的应用”，属于生物制药领域。所述保护视网膜神经节细胞的药物，其特征在于其有效成分为分离纯化的αB-晶体蛋白。本发明提供的药物中的有效成分αB-晶体蛋白能够显著促进视网膜神经节细胞RGCs的存活及轴突再生，试验证明，是一种对损伤后的视神经能起到恢复视功能的有效药物。
文档编号A61K9/08GK102210851SQ20111014497
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者吴楠, 应希, 王一, 王蕊, 黄小勇 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院