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Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols[Methods in Molecular medicine,第42卷，第 12章，第211-228页]，Ott等人，1995(MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines:Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology第 6 卷]Powell 和 Newman 编，W006/100110A1,以及 Lidgate 等人，1992 (SterileFiltration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)。·水包油乳液可以作为佐剂用于疫苗/免疫原性组合物中。由于这些乳液被施用给人类，所述乳液必须是无菌的。用作佐剂的水包油乳液是亚微米乳液，且油微滴足够小以穿过0. 2Mffl过滤器进行无菌过滤。本发明的一个目的是，提供一种用于生产亚微米水包油乳液的方法，尤其是水包油乳液的过滤。<br> <br/><b>发明内容</b><br> 本发明涉及一种用于生产亚微米水包油乳液的方法，尤其是亚微米水包油乳液的过滤。本发明提供了用于生产亚微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步骤<br> a.制备亚微米水包油乳液；<br> b.通过无菌级过滤器，预过滤所述水包油乳液；<br> c.通过与步骤b)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤b)滤过的水包油乳液。<br> <b>具体实施例方式</b>水包油乳液，尤其是亚微米水包油乳液，可以用作免疫学佐剂。肠胃外地施用包含与抗原(诸如流感抗原)相组合的所述水包油乳液的疫苗组合物，因而，所述水包油乳液必须是无菌的。本发明人已经证实，为了生产无菌的亚微米水包油乳液，通过单个无菌级过滤器过滤乳液是不够的。本发明人已经证实，为了提供无菌的水包油乳液，在用无菌级过滤器过滤之前，必须预过滤水包油乳液。因此，本发明提供了一种用于生产亚微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步骤<br> a.制备亚微米水包油乳液；<br> b.通过无菌级过滤器，预过滤所述水包油乳液；C.通过与步骤b)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤b)滤过的水包油乳液。在本发明的另一个实施方案中，提供了一种用于生产亚微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步骤<br> a.制备亚微米水包油乳液；<br> b.通过无菌级过滤器，预过滤所述水包油乳液；<br> c.通过与步骤b)的过滤器分离的过滤器，过滤根据步骤b)预滤过的水包油乳液；和<br> d.通过与步骤b)或c)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤c)滤过的水包油乳液。 在该具体实施方案中，在步骤c)中使用的过滤器可以具有这样的孔所述孔的大小范围是从无菌级过滤器的孔径(即约O. 至约2Mm的孔径。具体地，在上述实施方案中在步骤c)中使用的过滤器的孔径范围是从无菌级过滤器的孔径至约IMffl的大小。例如，在步骤b)中使用的过滤器的孔径是约2Mm、约2. 5Mm、约IMm、约O. 9Mm、约O. 8Mm、约O. 9Mm、约 O. 7Mm、约 O. 6Mm、约 O. 5Mm、0. 45Mm 或无菌级,例如约 O. 2Mm,例如 O. 22Mm。亚微米水包油乳液是这样的水包油乳液其中平均微滴尺寸小于lMm。测量微滴尺寸的方法是技术人员众所周知的，例如动态光散射。通过本领域技术人员已知的方法，例如但不限于高压匀浆化，例如使用微射流机，可以生产亚微米水包油乳液。在本发明的一个具体实施方案中，亚微米水包油乳液具有小于约220nm (O. 2Mm)、尤其是约120nm至约180nm的平均油微滴尺寸。“无菌级过滤器”是指，在大于或等于lxlOVcm2有效过滤面积的挑战水平，用微生物挑战以后，产生无菌流出液的过滤器。无菌级过滤器是本发明领域的技术人员众所周知的，且具有约O. 2Mffl的孔径，因而包括具有约O. 22ΜΠ1孔径的过滤器。所述过滤器的膜可以由技术人员已知的任意合适的材料制成，例如，但不限于醋酸纤维素、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)。在本发明的一个具体实施方案中，一个或多个或所有本发明的过滤器膜包含聚醚砜，例如亲水性聚醚砜。在本发明的另一个实施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法包括步骤；<br> a.制备亚微米水包油乳液；<br> b.预过滤所述水包油乳液；<br> c.通过无菌级过滤器，过滤根据步骤b)预滤过的水包油乳液；<br> d.通过与步骤b)或步骤c)的过滤器分离的过滤器，过滤根据步骤c)滤过的水包油乳液；<br> e.通过与步骤b)、c)和/或d)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤d)滤过的水包油乳液。在该具体实施方案中，在步骤b)和/或步骤d)中使用的过滤器可以具有这样的孔所述孔的大小范围是从无菌级过滤器(约O. 至约尤其是无菌级过滤器至约lMm。例如，在步骤b)和/或步骤d)中使用的过滤器的孔径是约2Mm、约2. 5Mm、约lMm、约O. 9Mm、约 O. 8Mm、约 O. 9Mm、约 O. 7Mm、约 O. 6Mm、约 O. 5Mm、0. 45Mm 或无菌级，例如约 O. 2Mm,例如0.22Mm。在步骤b)和d)中使用的过滤器可以具有彼此相同的孔隙率，或具有彼此不同的孔径。<br> 在本发明的一个具体实施方案中，提供了本发明的方法，其中每个过滤器的分压是约I至约I. 5巴，例如约I巴。在另一个实施方案中，提供了本发明的方法，其中在约15°C至约30°C、约16°C至约29°C、约17°C至约28°C、约16°C至约27°C、约16°C至约28°C、或22°C ±4°C的温度进行过滤。在本发明的一个实施方案中，所述亚微米水包油乳液包含约2%至约15%、约4%至约12%的油、约5%至约10%、约4%至约6%、约8%至约12%、例如约5%或10% (v/v)的油。为了使任意水包油组合物适合对人施用，所述油相必须包含可代谢的油(即可生物降解的)。所述油可以是任意植物油、鱼油、动物油或合成油，其对受体无毒，且能够通过代谢进行转化。坚果、种子和谷物是植物油的常见来源。合成油也是合适的。因此，本发明的水包油乳液包含可代谢的油，在一个具体实施方案中，本发明的水包油乳液包含角鲨烯(例如约4%至6% [v/V]) ο 本发明的水包油乳液还可以包含母育酚。母育酚是本领域众所周知的，且描述在EP0382271中。具体地，所述母育酚是α -生育酚或其衍生物，诸如α -生育酚琥珀酸盐(也称作维生素E琥珀酸盐)。在本发明的一个具体实施方案中，提供了包含角鲨烯(例如约5% [v/v])和α -生育酚(例如约5% [v/v])的本发明的水包油乳液。本发明的水包油乳液包含一种或多种表面活性剂。合适的表面活性剂是技术人员众所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)、脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)、磷脂酰胆碱(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂酰醚和辛苯昔醇-9 (TRITON X-100)。在本发明的一个具体实施方案中，水包油乳液包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80、聚山梨酯80)。在另一个实施方案中，本发明的水包油乳液包含聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和其它表面活性剂，尤其是脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)。在本发明的一个具体实施方案中，所述水包油乳液包含可代谢的油(例如角鲨烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[吐温80、聚山梨酯80])。在本发明的另一个实施方案中，本发明的水包油乳液包含可代谢的油(例如角鲨烯)、表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[聚山梨酯80])和任选的第二种表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯[司盘85])。在本发明的另一个实施方案中，本发明的水包油乳液包含可代谢的油(例如角鲨烯)、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂酰醚)和疏水性非离子表面活性剂(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯[(聚山梨酯80)])或脱水山梨糖醇三油酸酯[司盘85])。在本文中与本发明的“疫苗组合物”有关的实施方案也适用于与本发明的“免疫原性组合物”有关的实施方案，反之亦然。在每种情况下，发明人在本文中意图任选地用术语“由……组成”、“由……构成”分别替代术语“包含”、“包括”。与数字值ζ有关的术语“约”是指ζ±5%或10%。实施例方法<br> 乳化方法<br> 通过混合注射用水、磷酸盐缓冲盐水和吐温，在罐2中制备水相。通过混合生育酚和角鲨烯，在罐I中制备油相。搅拌两相，直到得到均质。用氮冲洗整个装置，以避免生育酚氧化。用膜泵给高压匀浆器供料。以需要的流量比，一起进料两相。使两相第I次穿过高剪切匀浆器，在这里得到粗乳液。然后，与高剪切匀浆器连通地，产物进入高压匀浆器，在这里得到细乳液。在混合装置的出口处，将产物收获在罐3中(第I次穿过)。当罐2和I空时，将·来自罐3的乳液导向混合装置的入口，进行第2次穿过。在第2次穿过结束时，将产物收获在罐2中。当罐3空时，将来自罐2的乳液导向混合装置的入口，进行第3次穿过。将乳液收犾在te 3中，并在过滤以如在氣下保减。过滤方法<br> 在I巴最大压力，在18-26°C之间的温度，在包含组合的O. 5/0. 2Mm膜的2个除菌过滤器上进行过滤，持续最大3小时的接触时间。为了证实过滤方法的效率，必须以IO7 CFU/cm2膜的浓度，用悬浮在乳液中的缺陷短波单胞菌(汉i/iffii/wte)挑战所述过滤器膜。为了找到最佳构造，测试了几种装置。在第一种装置中，以IO7 CFU /cm2膜的浓度，给所述产品接种缺陷短波单胞菌细菌，并在I巴最大压力，在18-26°C之间的温度，在2个O. 5/0. 2Mm过滤器上进行过滤。接种的产品和过滤器之间的接触时间最大为3小时。或者，首先在O. 5Mm平膜上预滤所述产品。然后以IO7 CFU /cm2膜的浓度，给所述产品接种缺陷短波单胞菌细菌，并在I巴最大压力，在18-26°C之间的温度，在O. 2Mm或<br> O.5/0. 2Mm或O. 2/0. 2Mm平膜上进行过滤。接种的产品和过滤器之间的接触时间最大为I. 5小时。最后，首先在含有O. 5和O. 2Mm过滤器的封装体(capsule)上预滤所述产品。然后以IO7 CFU /cm2膜的浓度，给所述产品接种缺陷短波单胞菌细菌，并在I巴最大压力，在18-26°C之间的温度，在O. 2Mm封装体上进行过滤。接种的产品和过滤器之间的接触时间最大为3小时。在所有情况下，在最后一个除菌膜之后收获滤液，并在O. 45Mffl收集过滤器上过滤整个体积，以便鉴别缺陷短波单胞菌的存在。将O. 45Mm过滤器铺在TSA板上，并在30°C温育7天。然后在第2、3、4和7天目检该板。如果观察到菌落，对它们计数并鉴别。结果<br> 在没有预滤或使用O. 5Mm预滤的情况下，在堵塞之前穿过过滤器的体积小于达到19.14 ml/cm2 (满足IO7 CFU/cm2的BCT要求所需)的目标保留体积所需的最小保留体积。当使用含有O. 5/0. 2膜的封装体作为预滤器进行预滤时，保留体积增加至最多19. 4 ml/cm2,且根本没有观察到传代(passage)。<br> <b>权利要求</b><br> 1.一种用于生产亚微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步骤 a.制备亚微米水包油乳液； b.通过无菌级过滤器，预过滤所述水包油乳液； c.通过与步骤b)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤b)滤过的水包油乳液。<br> 2.如权利要求I所述的方法，所述方法包括步骤 a.制备亚微米水包油乳液； b.通过无菌级过滤器，预过滤所述水包油乳液； c.通过与步骤b)的过滤器分离的过滤器，过滤根据步骤b)预滤过的水包油乳液；和 d.通过与步骤b)或c)的过滤器分离的过滤器，过滤根据步骤c)滤过的水包油乳液。<br> 3.根据权利要求2所述的方法，所述方法包括步骤； a.制备亚微米水包油乳液； b.预过滤所述水包油乳液； c.通过无菌级过滤器，过滤根据步骤b)预滤过的水包油乳液； d.通过与步骤b)或步骤c)的过滤器分离的过滤器，过滤根据步骤c)滤过的水包油乳液； e.通过与步骤b)、c)和/或d)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤d)滤过的水包油乳液。<br> 4.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中一个或多个过滤器膜包含聚醚砜，例如亲水性聚醚砜。<br> 5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述无菌级过滤器具有约O.2Mm、例如O. 22Mm的孔径。<br> 6.根据权利要求2、4或5中任一项所述的方法，其中在步骤c)中使用的过滤器具有下述孔径无菌级至约2Mm,例如约2Mm、约I. 5Mm、约IMm、约O. 9Mm、约O. 8Mm、约O. 9Mm、约.O. 7Mm、约 O. 6Mm、约 O. 5Mm、0. 45Mm 或无菌级，例如约 O. 2Mm,例如 O. 22Mm。<br> 7.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中在步骤b)和/或步骤d)中使用的过滤器可具有下述孔径无菌级过滤器(约O. 至约2Mm，尤其是无菌级过滤器至约lMffl，例如，约 2Mm、约 2. 5Mm、约 I Mm、约 O. 9Mm、约 O. 8Mm、约 O. 9μηι、约 O. 7Mm、约 O. 6Mm、约 O. 5Mm、.O. 45Mm或无菌级,例如约O. 2Mm,例如O. 22Mm。<br> 8.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中每个过滤器的分压是约I至约I.5巴，例如约I巴。<br> 9.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中在15°C至30°C、16°C至29°C、17°C至28°C、16°C至 27°C、16°C至 28°C、或约 22°C ±4°C进行过滤。<br> 10.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含2%至15%(v/v)的油。<br> 11.根据权利要求所述的方法，其中所述亚微米水包油乳液包含4%至6%(v/v)的油。<br> 12.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含8-12%(v/v)的油。<br> 13.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯和一种或多种表面活性剂。<br> 14.根据权利要求中任一项所述的方法，其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯、母育酚和表面活性剂。<br> 15.根据权利要求14所述的方法，其中所述母育酚是α-生育酚。<br> 16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂是聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80)。<br> 17.根据权利要求16所述的方法，其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和脱水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)。<br> 18.根据权利要求13所述的方法，其中所述亚微米水包油乳液包含角鲨烯、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子表面活性剂和疏水性非离子表面活性剂。<br> <b>全文摘要</b><br> 本发明提供了用于生产亚微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步骤a.制备亚微米水包油乳液；b.通过无菌级过滤器，预过滤所述水包油乳液；c.通过与步骤b)的过滤器分离的无菌级过滤器，过滤根据步骤b)滤过的水包油乳液。<br> <b>文档编号</b>A61K47/22GK102917688SQ201180028503 <br> <b>公开日</b>2013年2月6日 申请日期2011年6月8日 优先权日2010年6月10日<br> <b>发明者</b>V.德库佩雷, V.曼库索 申请人:葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司<br></p></p><div class="like"><h3>产品知识</h3></div><div class="like" style="margin-left:30px;"><h3>行业新闻</h3></div><div class="artbtom"><ul><li><div class="hotComments-recent-title"><div class="sdhssh4s"><a 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