专利名称：包含颗粒佐剂和免疫增强剂组合的流感疫苗的制作方法
技术领域：
本发明属于用佐剂配制疫苗来提供保护以抵御流感病毒感染的领域。
背景技术：
除了希龙疫苗公司(Chiron Vaccines)的FLUAD 产品利用MF59水包油乳液佐剂 外[1]，目前常规使用的流感疫苗不包含佐剂。参考文献2的第17和18章详细描述了这些疫苗。它们基于活病毒或灭活的病毒，灭活疫苗可以基于完整的病毒、“裂解”病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。血凝素(HA)是灭活流感疫苗的主要免疫原，参考HA水平标准化疫苗剂量，疫苗通常含有约15 μ gHA/毒株。流感爆发期需要大量流感疫苗，但难以增加疫苗供应从而满足巨大的需求。因此，除了生产更多疫苗抗原，有人提出可以使用较低含量的抗原/毒株，同时使用佐剂来弥补减少的抗原剂量。还有人提出在流行间期采用相同的方案，从而例如能覆盖更多人群而无需提闻生广水平。有人提示可用不可溶的颗粒佐剂[3]，例如铝盐[4-7]或微粒[8]改进流感疫苗。虽然这些佐剂配制的疫苗是有用的，但仍有提高的空间。因此，本发明的目的是提供佐剂配制的其它改进流感疫苗(对于流行期和流行间期使用)和它们的制备方法。

发明内容
现已发现含有不可溶颗粒佐剂的流感疫苗能引发IgG应答，主要是TH2应答(IgGl)。通过在组合物中加入免疫增强剂可将该应答改变为THl应答(IgG2a)。据报道，THl型应答[9]能提高针对流感病毒的异源亚型(heterosubtypic)免疫力。有利的是，还发现免疫增强剂能提高血凝素滴度和抗-血凝素ELISA滴度。因此，本发明提供包含⑴流感病毒抗原；(ii)不可溶的颗粒佐剂；和(iii)免疫增强剂的免疫原性组合物。本发明还提供制备免疫原性组合物的方法，其包括混合(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶的颗粒佐剂；和(iii)免疫增强剂的步骤。本发明提供装有以下组分的试剂盒(i)包含流感病毒抗原的第一试剂盒组分；和(ii)包含不可溶颗粒佐剂的第二试剂盒组分，其中(a)所述第一和第二组分包含免疫增强剂，或(b)所述试剂盒装有包含免疫增强剂的第三试剂盒组分。流感病毒抗原本发明组合物包含流感病毒抗原。通常可从流感病毒颗粒制备这些抗原，或者可在重组宿主(例如，利用杆状病毒载体的昆虫细胞)中表达诸如血凝素等抗原并以纯化形式使用[10、11]。然而,抗原一般来自病毒颗粒。
抗原可采用活病毒，或者更优选灭活病毒的形式。灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理洗涤剂、甲醛、福尔马林、β_丙内酯或紫外光。灭活的其它化学方法包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它们任何的组合处理。本领域知道灭活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙烯亚胺或Y射线。INFLEXAL 产品是完整的病毒颗粒灭活疫苗。如果使用灭活病毒，疫苗可包含完整的病毒、裂解病毒或纯化的表面抗原(包含血凝素，通常还包含神经氨酸酶)。可通过各种方法 从含病毒的液体收集病毒颗粒。例如，纯化方法可包括利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有洗涤剂以使病毒颗粒破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。用洗涤剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、Tergitol NP9，等等)处理病毒颗粒，包括“吐温-醚”裂解方法来产生亚病毒颗粒制品，从而获得了裂解病毒。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如参见参考文献12-17等。通常利用破裂浓度(disrupting concentration)的裂解剂(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，从而改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N, N- 二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蘧基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解发生在最初的病毒颗粒纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒颗粒的物质澄清(以除去非病毒颗粒物质)，浓缩收集的病毒颗粒(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分离完整病毒颗粒与非病毒颗粒物质，在密度梯度离心步骤中利用裂解剂裂解病毒颗粒(例如，利用含有裂解剂，如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度(溶液))，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和 FLUSHIELD 产品是裂解疫苗(split vaccine)。纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 产品是亚单位疫苗。流感抗原还可以病毒体形式存在[18]。流感病毒可以是减毒的。流感病毒可以对温度敏感。流感病毒可以是冷适应的。这三种可能性特别适用于活病毒。用于疫苗中的流感病毒毒 株每季不同。在目前的流行间期，疫苗通常包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明还可利用流行毒株(即，对疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三价疫苗为基础。然而，取决于季节和疫苗所含抗原的性质，本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒血凝素亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒NA 亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或 N9。可有用地包含在组合物中的其它毒株是耐受抗病毒治疗的毒株(例如，耐受奥塞米韦[19]和/或扎那米韦)的毒株，包括耐药性流行毒株[20]。本发明的佐剂配制的组合物特别可用于免疫接种以抵御流行毒株。能导致流行病爆发的流感毒株的特征在于(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出现超过10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中见到的毒株(例如，通常只在鸟群中发现的H5、H6或H9)，从而使得人群对该毒株的血凝素而言在免疫学上是原初的；(b)其能在人群中水平转移；和(c)其对人具有致病性。对于免疫接种抵御流行性流感，优选具有H5血凝素类型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、 H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出现的流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝I、HA进化枝I’、HA进化枝2或HA进化枝3 [21]，其中进化枝I和3特别相关。本发明组合物可包含一种或多种(例如，1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多种流感毒株，通常分别培养不同的毒株，收集病毒后混合来制备抗原。因此，本发明方法可包括混合多种流感毒株的抗原的步骤。流感病毒可以是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得。反向遗传学技术[例如，22-26]能利用质粒在体外制备含所需基因组区段的流感病毒。该技术通常涉及表达(a)例如能从poll启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能从polll启动子编码病毒蛋白质的DNA分子，从而使得在细胞中表达两种类型的DNA能装配完整的感染性病毒颗粒。DNA优选能提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能利用辅助病毒提供所述RNA和蛋白质中的一些。优选质粒方法，从而能用不同质粒产生各病毒RNA [27-29]，这些方法还包括利用质粒来表达所有病毒蛋白质或其中一些(例如，PB1、PB2、PA和NP蛋白质)，一些方法利用了 12种质粒。为减少所需的质粒数，最近的方法[30]在同一质粒上组合了多个RNA聚合酶I转录盒(对于病毒RNA合成)(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA区段的序列)，在另一质粒上组合了含RNA聚合酶II启动子的多个蛋白质编码区(例如，编码I、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感mRNA转录物的序列)。参考文献30所述方法的优选方面包括(a) —个质粒上的PBl、PB2和PA mRNA编码区；和(b) 一个质粒上的所有8个vRNA编码区段。包含一个质粒上的NA和HA区段和另一质粒上的6个其它区段也是有利的。除了用poll启动子编码病毒RNA区段，还可能用细菌噬菌体聚合酶启动子[31]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于poll启动子的种类特异性，细菌噬菌体聚合酶启动子对于许多细胞类型(例如，MDCK)更方便，虽然还必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。其它技术可能采用双重poll和polll启动子来同时编码一个模板的病毒RNA和可表达的mRNA [32、33]。因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是A/PR/8/34的6个区段，其中HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重配株)，特别是用卵培养病毒时。还可包含用于生产疫苗制备用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。通常，本发明保护抵御能人向人传播的毒株，因此毒株的基因组一般包含源自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一个RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区段。可用卵(通常是SPF卵)或细胞培养物培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法利用含胚的鸡蛋以及从鸡蛋内含物(尿囊液)中纯化病毒。然而，近年来用动物细胞培养物培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选该培养方法。如果采用鸡蛋培养病毒，贝1J可将病毒与一种或多种氨基酸一起引入鸡蛋的尿囊液中[15]。细胞物质通常是哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)和犬细胞。可利用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，例如VeiO细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此，合适的细胞系包括但不限于MDCK ；CH0 ；293T ；BHK ；Vero ;MRC_5 ；PER. C6 ；WI-38 ;等等。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞[34-37];源自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾脏的Vero细胞[38-40];或源自人胚胎成视网膜细胞的PER. C6细胞[41]。这些细胞系可广泛购自，例如美国模式培养物保藏所(ATCC) [42]、寇里尔细胞保藏中心(Coriell Cell Repositories) [43]或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81. 2、CRL_1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER. C6可以保藏号96022940购自ECACC0作为哺乳动物细胞系的次选替代，可用禽细胞系培养病毒[例如，参考文献44-46]，包括源自鸭(例如，鸭视网膜)或母鸡的细胞系，例如鸡胚胎干细胞(CEF)，等等。离子包括禽胚胎干细胞[44、47]，包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074 [48]。如果利用哺乳动物细胞系培养病毒，则组合物优选不含卵蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)和鸡DNA，从而能降低变应原性。培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34购自ATCC，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，参考文献34披露了适应于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系(“MDCK 33016”，以DSMACC2219保藏)。类似地，参考文献49披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。参考文献 50 披露了非致瘤性 MDCK 细胞，包括“MDCK-S” (ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101” (ATCCPTA-6501)、“MDCK-SF102” (ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。参考文献 51 披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括“MDCK. 5F1”细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。如果用细胞系培养病毒，则生长培养基以及用于启动培养的病毒接种物优选不含(即，经测试得到污染的阴性结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[52]。特别优选不含单纯疱疹病毒。如果用细胞系培养病毒，则每剂组合物优选含有少于IOng (优选少于lng，更优选少于IOOpg)的残留宿主细胞DNA，虽然可以存在痕量的宿主细胞DNA。总之，本发明组合物中的宿主细胞DNA不能长于IOObp。现在，检测残留的宿主细胞DNA是生物制品的常规要求，属于技术人员的普通能力。用于检测DNA的试验通常是确认试验[53、54]。可利用数学和可定量的术语描述确认试验的性能特征，已鉴定了其可能的误差来源。已总体上检验了该试验的诸如准确度、精密度、特异性等特征。一旦校验(例如，用已知标准量的宿主细胞DNA)及检验好某试验，可常规进行定量DNA检测。可采用三种主要的DNA定量技术杂交方法,例如Sourthern印迹或槽印迹[55];免疫测定方法，例如Threshold 系统[56];和定量PCR[57]。技术人员熟知这些方法，虽然各方法的精确特征取决于所研究的宿主细胞，例如杂交探针的选择，扩增用引物和/或探针的选择，等等。分子装置公司(Molecular Devices)的Threshold 系统是用于皮克水平总DNA的定量试验，其已用于监测生物药品中的污染DNA水平[56]。典型的试验包括在生物素化的ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗-ssDNA抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。所有试验组分均装入购自生产商的完整的总DNA测定试剂盒(TotalDNA Assay Kit)中。各种商品化生产商提供检测残留宿主细胞DNA的定量PCR试验，例如 AppTec 实验室服务公司(AppTec Laboratory Services)、BioReliance 、亚瑟技术公司(Althea Technologies)，等等。检测人病毒疫苗中宿主细胞DNA污染的化学发光杂交试验和总DNA Threshold 系统的比较见参考文献58。可采用标准纯化方法，例如层析等在疫苗制备期间除去污染性DNA。通过核酸酶处理，例如用DNA酶可促进除去残留的宿主细胞DNA。参考文献59和60披露了减少宿主细胞DNA污染的便利方法，其涉及两步处理，首先可在病毒培养期间使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒颗粒破裂期间使用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。用烷化剂，例如β -丙内酯处理也可用于除去宿主细胞DNA，该方法还可优选用于灭活病毒颗粒[61]。
优选在每15yg血凝素中含有<10ng (例如，<lng、〈100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每O. 25ml体积含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主细胞DNA的疫苗。更优选在每50 μ g血凝素中含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每O. 5ml体积含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主细胞DNA的疫苗。优选任何残留宿主细胞DNA的平均长度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于IOObp,等等。对于用细胞系，例如MDCK细胞培养，可用悬液培养[34、62、63]或贴壁培养的细胞来培养病毒。用于悬液培养的一种合适的MDCK细胞系是MDCK 33016(保藏号为DSM ACC2219)。或者，可采用微载体培养。优选用无血清的培养基和/或无蛋白质的培养基培养支持流感病毒复制的细胞系。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。支持流感病毒复制的细胞系优选在37°C以下生长[64](例如，30-36 °C，或约30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C )，例如在病毒复制期间。在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤给培养的细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。以病毒和细胞之比为1:500-1:1，优选1:100-1: 5，更优选1:50-1:10 (通过PFU或TCID5tl检测)接种培养的细胞。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40°C，优选28-37°C，在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，从而增加了收集的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约O. 0001 - 10，优选O. 002 - 5，更优选O. 001-2的感染复数(“m. o. i. ”)感染培养的细胞。更优选以约O. 01的m. ο. i.感染细胞。感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原,参考HA水平使疫苗剂量标准化,一般通过单向辐射状免疫扩散(SRID)试验检测。疫苗通常含有约15 μ gHA/毒株，虽然在例如儿童，或流行情况下还可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3X或9X剂量[65、66]) 一样，已使用了部分剂量，例如V2WPasyg HA/毒株hVdPVUej]。因此，疫苗可包含 O. 1-150 yg HA/ 流感毒株，优选 O. 1-50 μ g,例如 O. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g，等等。具体的剂量包括，例如约45、约30、约15、约10、约7. 5、约5、约3. 8、约I. 9、约I. 5，等等。与本发明一样，当疫苗中存在佐剂时，这些较低的剂量最有用。对于活疫苗，通过中值组织培养感染剂量(TCID5tl)而不是HA含量来检测给药，每种毒株的TCID50 一般在IO6-IO8之间(优选IO6 5-IO7 5)。本发明所用的HA可以是病毒中发现的天然HA，或者可经修饰。例如，已知可修饰HA以除去致使病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，围绕HAl和HA2之间的切割位点的超碱性区域(hyper-basic region)),否则这些决定簇可阻止病毒在卵中生长。本发明试剂盒的抗原组分可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇_9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)，或脱氧胆酸钠，特别是对于裂解或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗涤剂。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、α-生育酚半琥珀酸酯(a -tocopheryl hydrogen succinate)和聚山梨醇酯80各自低于lmg/ml。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。灭活但非全细胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包含基质蛋白，从而受益于位于该抗原内的其它T细胞表位。因此，包含血凝素和神经氨酸酶的非全细胞疫苗(特别是裂解疫苗)还可包含Ml和/或M2基质蛋白。如果存在基质蛋白，优选包含可检测水平的M2基质蛋白。还可存在核蛋白。不可溶的颗粒佐剂本发明的组合物和试剂盒包含不可溶的颗粒佐剂。本发明所用的合适不可溶颗粒佐剂的离子包括但不限于铝盐、钙盐和微粒。不可溶的颗粒佐剂的功能通常是作为吸附剂，从而能在混合抗原和佐剂时将抗原(例如，血凝素)能吸附到佐剂上。然而对于微粒，作为将抗原吸附到颗粒表面的替代方法(或者除了将抗原吸附到颗粒表面)，还可能将抗原包裹在颗粒的内部。
合适的铝盐包括称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是惯常的，但只是为方便而使用，并未精确描述所存在的实际化学构成[例如，见参考文献67的第9章]。本发明可用常规用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。称为“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分结晶。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)J^区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070CI!!—1处存在吸收带和在3090-3100( ^处存在强烈的肩峰[参考文献67的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的Pl通常约11，即在生理PH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7. 4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每mg A1+++1. 8-2. 6mg蛋白质之间。称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝，这些佐剂也常含有少量硫酸根(即，羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该 盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中P04/A1摩尔比通常在O. 3-1. 2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的A1P04。例如，3164CHT1的IR光谱带(例如，当加热至200°C时)表明存在结构性羟基[参考文献67的第9章]。磷酸铝佐剂的P04/A13+摩尔比通常在O. 3-1. 2之间，优选在O. 8-1. 2之间，更优选0.95±0. I。磷酸铝通常是无定形的，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂是P04/A13+摩尔比在O. 84-0. 92之间，含O. 6mg Al3+/ml的无定形羟基磷酸铝。磷酸铝通常是颗粒状的(例如，电子透射显微照片中所见的平板样形态)。这些颗粒在吸附任何抗原后的典型直径是O. 5-20 μ m(例如，约5-10 μ m)。据报道，ρΗ7· 4时，磷酸铝佐剂的吸附能力在每mgA1+++0. 7-1. 5mg蛋白质之间。磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度成反比，而该取代程度依据沉淀制备该盐所用的反应条件和反应物浓度而不同。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通过添加例如组氨酸缓冲液(使得PZC更具碱性)等缓冲液来改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常在4. 0-7. O之间，更优选在5. 0-6. 5之间，例如约5. 7。本发明所用的铝盐悬液可含有缓冲液(例如，磷酸或组氨酸或Tris缓冲液)，但不一定。这些悬液优选无菌、无热原。悬液可含有游离的水性磷酸根离子，例如浓度在1.0-20mM之间、优选在5-15mM之间、更优选约10mM。这些悬液也可含有氯化钠。在本发明的一个实施方式中，佐剂包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物[6]。在这种情况中，磷酸铝可能多于氢氧化铝，例如重量比至少为2:1，例如彡5: I、彡6: I、彡7: I、彡8: I、^ 9:1，等等。给予患者的组合物中Al+++的浓度优选低于10mg/ml,例如< 5mg/ml、i^ 4mg/ml、 3mg/ml、i^ 2mg/ml、i^ lmg/ml,等等。优选的范围在 O. 3-lmg/ml 之间。优选最大〈O. 85mg/剂。輕盐在各种钙盐中，通常只用磷酸钙作为佐剂。现已报道了磷酸钙的各种佐剂形式，本发明可用任何这些形式。
水合磷酸钙凝胶佐剂可购自丹麦瓦德贝克市的斯由普夫公司(Superfos，Vedbaek, Denmark)。1995年，参考文献67的第8章总结了磷酸钙佐剂。可通过在有抗原存在下原位沉淀该盐，或通过吸附至预形成的盐上而将抗原吸附到磷酸钙上。述及了预形成的磷酸钙凝胶的商品化来源。详细给出了沉淀条件对佐剂的物理化学特征，包括吸附能力的影响。参考文献68报道了各种磷酸钙佐剂的结构和吸附特性。据报道，这些佐剂是式Ca1Q_x (HPO4) x (PO4) 6_x (OH) 2_x所示的非化学计量羟基磷灰石，而不是严格的Ca3 (PO4) 2，其表面电荷取决于pH，零电荷点(PZC)为5. 5。佐剂可以形成尺寸约IOnmX 150nm的针状颗粒以及直径约20-30nm的不规则形状的片。参考文献69披露了含有反应活性空位(reactive vacant site)的反应活性无定形磷酸I丐，通过使碳酸化的无定形磷酸I丐的碳酸盐预组分(pre-component)热分解成气态 或汽化副产物来除去所述预组分而获得这些反应活性位点。参考文献70和71披露了颗粒磷酸钙佐剂(“CAP”)，其中所述颗粒的直径为300-4000nm (纳米颗粒)，形状为球形，表面平滑。参考文献72披露这些颗粒可用于粘膜免疫。参考文献还披露了了粘膜免疫，其中疫苗接种哺乳动物以产生IgA抗体应答的方法利用大小适于经上皮转运的颗粒羟基化磷酸钙。参考文献74披露了在体内可溶的复合颗粒，其包含聚合物颗粒，所述颗粒表面包被有Ca/P之比约I. 0-2. O的磷酸钙化合物。参考文献75披露了用于吸附疫苗的可注射水性磷酸钙凝胶，其中钙离子和磷酸根离子的组合比例使得重量比Ca/P为I. 62-1. 85，从而在20°C当每升含O. 07个Ca原子时该凝胶的沉淀时间为10分钟内沉降I-20mm。磷酸钙佐剂的Ca与P摩尔比可以不同，例如在I. 35-1. 83之间[见参考文献67的第8章]。现已发现佐剂的吸附特性依据沉淀期间所用的条件而有所不同，例如缓慢混合所得佐剂的吸附性能低于快速混合形成的佐剂。本发明疫苗中以Ca++检测的磷酸钙含量可以在O. lmg/ml和10mg/ml之间，例如在0. 5_5mg/ml 之间，优选 0. 75_3mg/ml、0· 9-1. 5mg/ml 之间或约 lmg/ml。磷酸钙佐剂能吸附抗原。对于某给定的抗原，以抗原的总重量计，吸附了至少80% (例如，彡 85%、彡 90%、彡 92. 5%、彡 95%、彡 97. 5%、彡 97. 5%、彡 98%、彡 99%、彡 99. 5%,等等)。由于磷酸钙佐剂不可溶，采用以下方法可方便地检测吸附程度，所述方法包括离心然后测定固体或可溶物质之一(或二者)中的抗原含量。离心后，未吸附的抗原维持在溶液中。例如，参考文献76采用该方法检测了磷酸钙佐剂的吸附能力。当(a)白喉类毒素水平升高到IOOLf以上和(b)破伤风类毒素水平升高到25Lf以上时，将白喉和破伤风类毒素吸附到Img Ca++上是不完全的。对于吸附，优选利用加入了一种或多种流感抗原的水性悬液形式磷酸钙佐剂。可先将钙盐稀释至所需浓度再加入抗原。微粒将微粒用作佐剂已见描述，例如见参考文献77和78。优选的微粒由生物可降解和无毒聚合物制成。例如，可用选自下组的聚合物制成聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚己酸内酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。还可利用这些聚合物的共聚物，例如或者D，L-丙交酯和己内酯的共聚物。优选的聚合物是聚(α-羟酸)，更优选选自下组的那些聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。最优选的聚合物是称为“PLG”的聚(D, L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物。优选的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物是丙交酯/乙交酯摩尔比为25:75-75:25，更优选40:60-60:40，例如约50:50的那些。含有50%D, L-丙交酯和50%乙交酯的50:50PLG聚合物是快速吸附的聚合物，而因为丙交酯分量增加，75:25PLG降解较慢，85:15和90:10甚至降解更慢。可获得各种分子量的这些聚合物，本领域技术人员不难测定某给定抗原的合适分子量。对于聚交酯，例如合适的分子量是约2000-5000级别的。对于PLG，合适的分子量通常是约 10，000-约 200，000，优选约 15，000-约 150，000，最优选约 50，000-约 100，000。有用的范围是30，000道尔顿-70，000道尔顿。 微粒的直径为约IOOnm-约150nm,更优选直径约200nm_约30 μ m,最优选直径约500nm-约10 μ m。一般它们基本上是球形的。可采用各种方法制备微粒。例如，已知有双乳液/溶剂蒸发技术，该技术包括形成由聚合物溶液液滴构成的初级乳液，随后与含有颗粒稳定剂/表面化学表面活性剂的连续液相混合。更具体地说，如参考文献79中所述，可利用水包油包水(w/o/w)溶剂蒸发系统形成微粒。在该技术中，将特定的聚合物与有机溶剂，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、丙酮、氯仿等混合。聚合物在有机溶剂中形成约2-15%，更优选约4-10%，最优选6%的溶液。利用，例如匀浆器乳化聚合物溶液。然后将乳液与乳液稳定剂，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮的大体积水溶液混合。乳液稳定剂通常形成约2-15%的溶液，更常见形成约4-10%的溶液。然后匀浆该混合物产生稳定的w/o/w双重乳液。随后蒸发有机溶剂。可调节制剂参数以沉淀小的(<5ym)和大的(>30 μπι)微粒。例如，慢速搅拌可获得大颗粒，因为增大了内相体积。可通过常规方法测定颗粒大小。除了采用双乳液技术，还可采用单乳液技术。还可采用喷雾干燥和凝聚，或通过空气悬浮包衣技术，例如锅包衣和Wurster包衣形成微粒。还可利用离子凝胶。 制备后，可按原样保存微粒，或可冻干待用。将抗原悬浮到制备的微粒上的一种方法如下所示。利用可透析的洗涤剂将微粒再水合并分散成基本上单体的微粒悬液。有用的洗涤剂包括但不限于各种N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)(称为MEGA)，例如庚酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-7)、辛酰基-N甲基葡糖酰胺(MEGA-8)、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-9)和癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10);胆酸；胆酸钠；脱氧胆酸；脱氧胆酸钠；牛磺酸；牛磺酸钠；牛磺去氧胆酸(taurodeoxycholic acid);牛磺去氧胆酸钠；3[(3_胆酰胺(cholamido)丙基)二甲基铵基(dimethylammonio) ]-1_丙磺酸酯(CHAPS) ;3_[ (3-胆酰胺丙基)二甲铵]_2_轻基-I-丙磺酸酯(CHAPSO) ;N-十二烷基-N，N- 二甲基-3-铵基(ammoniol)-丙磺酸酯(ZWITTERGENT3-12) ；N, N-双-(3-D-葡糖酰氨基丙基(gluconeamidopropyl))-脱氧胆酰胺(deoxycholamide) (DEOXY-BIGCHAP) ;N辛基葡糖苷；鹿糖单月桂酸酯(sucrosemonolaurate);甘氨胆酸/甘氨胆酸钠；月桂肌氨酸(Iaurosarcosine)(钠盐)；葡糖脱氧胆酸(glycodeoxycholic acid)/ 葡糖脱氧胆酸钠(sodium glycodeoxycholate)。所用的洗涤剂与微粒之比(W:w) —般约为O. 0156:1，更优选约O. 625:1，甚至更优选约O. 25:1，最优选约1:1-2: I。然后物理研磨微粒/洗涤剂混合物，例如使用陶瓷研钵和研棒，直至形成光滑的浆液。然后加入合适的水性缓冲液，例如磷酸缓冲盐水(PBS)或Tris缓冲盐水，超声处理或匀浆得到的混合物直至微粒完全悬浮。随后向微粒悬液中加入感兴趣的抗原，整个系统进行透析以除去洗涤剂。聚合 物微粒和洗涤剂系统的选择最好使得感兴趣的抗原能吸附到微粒表面同时仍能维持抗原的活性。可以洗去含有表面吸附抗原的所得微粒的未结合抗原，将其作为合适缓冲制剂的悬液保存，或用合适的赋形剂冻干，如下文进一步描述的。可任选处理微粒以获得带负电荷的表面(例如，用SDS)或带正电荷的表面(例如，用阳离子洗涤剂，如CTAB)。根据待吸附的抗原，表面特征变化可改变吸附特征。免疫增强剂本发明组合物包含免疫增强剂，发现联用免疫增强剂和不可溶的颗粒佐剂获得了出乎意料有效的免疫原性组合物。优选的免疫增强剂是Toll样受体(TLR)激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一种或多种的激动剂。优选的免疫增强剂是TLR7的激动剂(例如，咪唑并喹啉类)和/或更优选TLR9的激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。这些免疫增强剂可用于活化先天免疫途径。典型的免疫增强剂是有机化合物，通常不是聚合物。它们的分子量可低于2kDa，例如 <1800Da、<1600Da、<1400Da、<1200Da、〈lOOODa、<800Da、<600Da、<500Da、<400Da、<300Da或 <200Da。合适的免疫增强剂包括但不限于 免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酯键与鸟嘌呤连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或双链RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸。· 3-0-脱酰基单磷酰脂质 A ( “3dMPL”，也称为 “MPL ” ) [80-83]。 咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[84、85]、瑞喹莫德(“R-848”)[86]和它们的类似物；和它们的盐(例如，盐酸盐)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节见参考文献87-91。·缩氨基硫脲化合物，例如参考文献92披露的那些。参考文献92还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。·色胺酮化合物，例如参考文献93披露的那些。参考文献93还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。 核苷类似物，例如(a)艾沙托拉滨(Isatorabine) (ANA-245 ;7_硫杂_8_氧代鸟
苷)及其前药
jrVVo
wan入I
OO
(b) ANA975 ； (c) ANA-025-1 ； (d) ANA380 ； (e)参考文献 94-96 所述的化合物；(f)下
式所示化合物
权利要求
1.一种免疫原性组合物，其包含(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶颗粒佐剂；和(iii)免疫增强剂。
2.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述流感病毒抗原是灭活病毒。
3.如权利要求I所述的组合物，其特征在于，所述流感病毒抗原包含完整的病毒、裂解病毒或纯化的表面抗原。
4.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述流感病毒抗原来自HI、H2、H3、H5、H7或H9甲型流感病毒亚型。
5.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，从用细胞培养物培养的流感病毒制备所述流感病毒抗原。
6.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，从用卵培养的流感病毒制备所述流感病毒抗原。
7.如权利要求1-5中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物不含卵白蛋白、卵类黏蛋白和鸡DNA。
8.如权利要求5或7所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含少于IOng细胞培养宿主的细胞DNA。
9.如权利要求5或7所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含的100个核苷酸或更长的DNA少于10ng。
10.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含O.1-20 μ g血凝素/病毒毒株。
11.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述不可溶颗粒佐剂选自铝盐；钙盐；和微粒。
12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述不可溶颗粒佐剂包含氢氧化铝。
13.如权利要求11或12所述的组合物，其特征在于，所述不可溶颗粒佐剂包含磷酸铝。
14.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述不可溶颗粒佐剂包含磷酸钙。
15.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述不可溶颗粒佐剂包含由聚(丙交酯-共-乙交酯)制成的微粒。
16.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述免疫增强剂是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9中的一种或多种的激动剂。
17.以上任一项权利要求所述的组合物，其特征在于，所述免疫增强剂是免疫刺激性寡核苷酸。
18.不可溶颗粒佐剂；和(iii)免疫增强剂。
19.一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括混合以下组分的步骤(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶颗粒佐剂；和(iii)免疫增强剂。
20.一种装有以下组分的试剂盒(i)包含流感病毒抗原的第一试剂盒组分；和(ii)包含不可溶颗粒佐剂的第二试剂盒组分，其中(a)所述第一组分或所述第二组分包含免疫增强剂，或(b)所述试剂盒装有包含免疫增强剂的第三试剂盒组分。
全文摘要
发现含有不可溶颗粒佐剂的流感疫苗能引发主要是TH2应答(IgG1)的IgG应答。通过在组合物中加入免疫增强剂可使该应答向TH1应答(IgG2a)转变。因此，本发明提供包含以下组分的免疫原性组合物(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶颗粒佐剂；和(iii)免疫增强剂。
文档编号A61K39/39GK102727885SQ20121022360
公开日2012年10月17日 申请日期2006年11月6日 优先权日2005年11月4日
发明者D·奥黑根, G·德尔古迪斯, R·拉普奥里 申请人:诺华疫苗和诊断有限公司