专利名称：Btg2在制备抑制癌症转移药物中的应用的制作方法
BTG2在制备抑制癌症转移药物中的应用技术领域
本发明属于基因药物领域，具体涉及BTG2基因(B细胞迁移基因幻在制备抑制癌 症转移药物中的应用。
背景技术：
乳腺癌是威胁女性健康的主要恶性肿瘤之一。据美国癌症学会2010年最新统计 数据，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤第一位，死亡率居女性恶性肿瘤第二位。在我国，乳腺 癌的发病率也呈逐年上升趋势，近10年来，我国乳腺癌发病率增加了 47%。与欧美国家 相比较，中国乳腺癌病人的年龄呈现年轻化趋势。按我国12亿人口计算，每年将新发现 211，000例乳腺癌。乳腺癌治疗最终失败并导致患者死亡的主要原因是远处转移。
因此，需要研发出一种抑制癌症转移的药物。
现有技术中，关于BTG2基因的报道，主要集中在其抑制肿瘤增长方面的应用， 例如马晓明、倪克樑等利用RT-PCR法研究31例人胰腺癌及同例癌旁组织BTG2mRNA的 表达，利用免疫沉淀法检测其BTG2蛋白的表达，用pcDNA3. 1-BTG2质粒转染人胰腺癌 细胞株swl990，用MTT法测定质粒转染后swl990/pcDNA3. 1-BTG2细胞生长曲线；应用 AnnexinV-FITC凋亡检测试剂，用流式细胞仪测定swl990/pcDNA3. 1-BTG2细胞凋亡的情 况，结果发现BTG2基因在人胰腺癌中的表达下调可能与其恶性行为有关；BTG2基因的过度 表达可通过诱导凋亡而抑制人胰腺癌细胞株swl990的生长(参见马晓明、倪克樑.世界 肿瘤杂志· 20-24)。
然而BTG2基因在制备抑制癌症转移药物的应用国内外至今未见报道。 发明内容
本发明目的是提供一种BTG2基因的新应用，即BTG2基因在制备抑制癌症转移药 物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是BTG2基因在制备抑制癌症转移药物 中的应用，具体的，脂质体介导的真核表达质粒PCDNA3-BTG2在制备抑制癌症转移药物中 的应用。
本发明同时要求保护一种抑制癌症转移药物，所述抑制癌症转移药物的活性成分 包括携带BTG2基因的真核表达质粒。
上述技术方案中，所述携带BTG2基因的真核表达质粒为真核表达质粒 pcDNA3-BTG2。
上述技术方案中，真核表达质粒PCDNA3-BTG2的制备方法为现有技术，可以参见 文献张林、侯艳红、王孟薇、吴本俨、李楠.中华肿瘤防治杂志.200815 (16)。
上述技术方案中，所述癌症包括但不限于乳腺癌。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
本发明将脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2导入肿瘤细胞，使BTG2基因在3肿瘤细胞中表达，然后BTG2基因通过抑制肿瘤细胞周期进程和影响细胞周期进程和细胞 转移相关蛋白的表达，抑制了肿瘤细胞的远处转移能力。


图1为实施例一中转染BTG2质粒后MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG^nRNA表 达情况；
图2为实施例一中转染BTG2质粒后MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞BTG2蛋白表 达水平；
图3为实施例一中BTG2基因抑制MCF-7细胞迁移；
图4实施例一中BTG2基因抑制MDA-MB-231细胞迁移；
图5为实施例一中BTG2基因抑制MCF-7和MDA-MB-231细胞转移；
图6为实施例一中SuperArray转移相关基因芯片(0HS-028)中含有的基因；
图7为实施例一中转染BTG2基因后MDA-MB-231细胞SuperArray结果；
图8为实施例一中BTG2转染MDA_MB_231细胞肺克隆实验典型图9为实施例一中裸鼠正常肺脏和肺转移病理(HE，X 200)；其中，A裸鼠正常肺 脏病理，B裸鼠肺转移灶病理。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一
材料人乳腺癌细胞株MDA-MB-231及MCF-7购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并 由本实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉，小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司；标准蛋 白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲液、RIPA蛋白裂解液、TE电泳缓冲液、IOX转膜液、30% Acry-Bis、Tris-Hcl、过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏 碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜(DMS0)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物工程 有限公司；抗BTG2、cyclin Bi、cyclin Dl等抗体购自美国Santa Cruzs生物技术公司。 RNase A 和 10g/mL proteinase K 购自美国 Sigma Aldrich 公司。
1)细胞培养MDA-MB_231及MCF-7细胞培养于含10%小牛血清，谷氨酸胺及100 万U/L青霉素和链霉素的D-EME培养基。细胞置于5% CO2, 37°C培养箱内培养，每2_3天 传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
2)细胞的转染和克隆筛选转染前一天，将细胞用胰酶消化、计数，以合适的密度 接种6孔板，置于CO2培养箱中培养过夜，使转染当日细胞融合度为70% 90%。在铺板 和转染期间避免使用抗生素。转染溶液配制质粒LipOfectamine2000用量比为1 μ g/ 孔2. 5 μ 1/孔。2 μ g/孔DNA加入100 μ 1/孔DMEM混勻，室温静置5min，备用；5 μ 1/孔 Lipofectamine2000加入100 μ 1/孔基础DMEM混勻，室温静置5min，备用；将稀释的DNA同 稀释的脂质体试剂混合，在室温保温30min后，加入800 μ 1/孔基础DMEM，备用。用PBS及 无抗生素的基础DMEM洗涤细胞，每孔加入Iml转染混合液，5% C02，37°C培养证。证后，弃 去含转染试剂的培养液，加入新鲜的完全培养基，继续培养后，72小时内完成实验即为瞬时 转染；如果细胞继续培养4 后，更换含G418的培养基，大约两周后，筛选阳性稳定克隆，即为稳定转染。
应用脂质体转染的方法，将前述所构建的真核表达质粒pCDNA3-BTG2分别转染到 人类乳腺癌MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞，同时转染“空”的pcDNA3质粒作为阳性对照。 MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞转染BTG2基因后的RT-PCR电泳图见图1。从图中可以看 出，MCF-7/BTG2细胞和MDA-MB-231/BTG2细胞中BTG2mRNA明显高表达，而相应的母细胞和 空质粒细胞中BTG2mRNA均为极低表达。MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞转染BTG2基因后 的Western blot电泳图见图2。从图中可以看出，MCF-7/BTG2和MDA-MB-231/BTG2细胞中 的BTG2蛋白表达水平明显高于相应的母细胞和转染“空”质粒的细胞，同时，母细胞和转染 “空”质粒的细胞BTG2蛋白表达水平相同。
以上结果从RNA水平和蛋白水平均证明，BTG2基因已经转染进入乳腺癌细胞 MCF-7和MDA-MB-231细胞，并且可以使乳腺癌细胞高表达BTG2蛋白，同时“空”的pcDNA3 质粒没有影响BTG2蛋白表达。
上述flfestern-blot法方法的主要过程为收集细胞并转至于1. 5ml的Eppendorf 管中离心O500转/分)5分钟，弃上清，并加入ΙΟΟμ 1 IP裂解液，置于冰上2小时。4。C 离心5分钟(2，500转/分钟)，转移上清液至新的Eppendorf管，并采用分光光度计检测样 品蛋白含量。加入蛋白上样缓冲液(5Χ)混勻，置于恒温混勻器上，100°C 5分钟，蛋白电泳 后转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5%脱脂奶粉，IXT-BST缓冲液)封闭lh。洗涤，并 分别加入一抗β-Actin，BTG2，Cyclin Bi, Cyclin D1，经封闭液处理的醋酸纤维膜室温抚 育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，加入二抗(1 1000稀释)抚育1小时。T-BST缓冲液 洗膜3次，最后加ECL发光剂，显影、定影，胶片洗涤和干燥后，扫描分析。
3)体外划痕实验采用体外划痕方法测定细胞迁移能力。取对数生长期细胞，按 IXlO6Ail接种于6孔培养板，培养至细胞完全饱和。用无菌2001的Tip头垂直划出一无 细胞的细痕，制作培养细胞伤口模型，并用无菌IXPBS小心清洗三次去除漂浮细胞(此时 作为划痕后0时刻)。每板接种三种细胞，每种细胞设2个复孔。最后分别继续培养M小 时和48小时，在显微镜下观察划痕宽度，并采用数码照相机拍照。
应用体外细胞划痕实验方法检测BTG2基因对乳腺癌细胞体外迁移能力的影响。 图3为转染BTG2基因后MCF-7细胞的划痕实验结果，从图中可以看出，随时间延长，细胞向 划痕区域浸润扩散，MCF-7/BTG2细胞较MCF-7和MCF-7/Neo细胞浸润慢，在划痕后48小时， MCF-7/BTG2细胞划痕间隙明显大于MCF-7细胞和MCF-7/Neo细胞，而MCF-7细胞和MCF-7/ Neo细胞之间差异不明显。
图4为转染BTG2基因后MDA-MB-231细胞的划痕实验结果，与MCF-7细胞类似， 在划痕后48小时，MDA-MB-231和MDA-MB-231/Neo细胞已经浸润扩散覆盖了划痕间隙，而 MDA-MB-231/BTG2细胞仍可看到明显的划痕间隙。
以上实验结果说明BTG2基因表达水平的提高可以抑制或降低乳腺癌细胞MCF-7 和MDA-MB-231的迁移能力，同时也说明“空”pcDNA 3质粒对乳腺癌细胞的迁移能力没有明显影响。
4) Boyden 小室实验
采用Boyden小室法测定细胞转移能力。在Boyden下室加入含20%的新生牛血清 的DMEM培养基，采用8 μ m人工基底膜将两室隔开。加40 μ 1不含血清的DMEM培养基制备5的单细胞悬液(IXlO6Ail)接种到Boyden上室中。细胞置于37 °C、5% CO2饱和湿度培养8 小时。小心将基底膜取出，甲醇固定，并采用Giemsa染色，用棉签将未穿过膜的细胞小心擦 去，然后在显微镜下观察并拍照。
应用体外Boyden小室实验方法研究BTG2基因对乳腺癌细胞MCF-7和MDA_MB_231 转移能力的影响。结果如图5所示，使用8μπι人工基底膜，8小时之后，MDA-MB-231和 MDA-MB-231/Neo均有大量细胞穿过基底膜，而MDA-MB-231/BTG2细胞仅有少量细胞穿过基 底膜。MCF-7细胞也有同样的结果。通过在显微镜(100倍)下计数每视野穿过基底膜的 细胞数目，每组细胞计数6个视野，应用SAS8. O统计软件，对数据进行方差分析。结果发 现:MDA-MB-231 与 MDA-MB-231/Neo 之间 ρ = 0. 2123，差异无统计学意义，MDA-MB-231 与 MDA-MB-231 /BTG2、MDA-MB-231 /Neo 与 MDA-MB-231 /BTG2 之间，ρ 值均 < O· 01，细胞数具有明 显差异。MCF-7与MCF-7/Neo之间ρ = 0. 0892，差异无统计学意义，MCF-7与MCF-7/BTG2、 MCF-7/Neo与MCF-7/BTG2之间，ρ值均< 0. 01，细胞数具有明显差异。以上结果说明，BTG2 基因表达增加可以抑制了乳腺癌细胞MCF-7，MDA-MB-231的转移能力。
5) SuperArray功能分类基因芯片实验应用美国SABiosciences公司的 SuperArray 转移相关基因芯片(0HS-028)，对 MDA-MB-231/Neo 和 MDA-MB-231/BTG2 细胞分 别进行检测，具体方法如下
首先提取待测细胞的总RNA(具体方法同RT-PCR)；提取总RNA后进行测量总RNA 溶解于 RNase-free water, A260 > llng/ul, A260/A280 > 2. 0，A260/A230 > 1. 7 ；进行变 性琼脂糖电泳(看RNA的完整性，18S和28S条带)；应用"TrueLabeling_AMP2. O试剂盒进行 cRNA合成与放大，具体步骤参照试剂盒说明进行。纯化后、Biotin标记的cRNA即可用于上 含基因芯片的膜杂交含基因芯片的每个杂交管中加入Iml的杂交缓冲液，然后加入20 μ g 的biotin标记的cRNA，上杂交炉60°C，15 20转/min，过夜。按说明将经过杂交的基因 芯片膜洗涤后，应用CDP-Mar化学发光试剂盒进行反应显色。对反应后的基因芯片膜应用 Kodak X光片进行曝光、显影后，得到superarray图像，然后根据相应基因位点对图像进行 分析。
结果如图6所示，0HS-028转移相关基因芯片上含有与肿瘤转移相关的113个基 因。经过分析，有7个基因有较明显差异，结果如图7所示，分别为SET、NMEU NME2、RBI、 RH0C、PLAUR和P53。其中，BTG2基因导致上调的是SET、NMEl、NME2、RBl和P53基因，导致 下调的是RHOC和PLAUR。
SET、RB和P53基因与调节细胞周期、凋亡有关，BTG2基因引起这些基因上调，说明 BTG2对细胞周期和凋亡的作用可能与上调这些基因表达，影响了相关的信号通路有关。
NMEU NME2、RHOC和PLAUR这些基因与肿瘤细胞的转移能力有关，BTG2基因引起 这些基因的上调和下调，说明BTG2基因对肿瘤细胞转移的抑制可能与这些基因相关的信 号通路有关。
6)乳腺癌转移模型建立取对数生长期MDA-MB-231/Neo细胞、MDA-MB-231/BTG2 细胞，经0. 25%胰蛋白酶消化，离心去上清，而后用基础培养液离心洗涤2次，计数细胞数， 调整细胞浓度为IX IO6个/mL，将细胞重悬于无菌PBS溶液。取前述裸鼠12只，每种细胞 种6只，将裸鼠放入固定器中，在严格无菌条件下经尾静脉注入细胞悬液0. 2mL·裸鼠肿瘤 接种后，连续置恒温(25°C ±2°C)、恒湿(45% 50%)、无菌净化屏障系统内饲养，定期观察裸鼠精神、饮食和排便。裸鼠饲养4周脱颈处死，解剖，取出双肺。Bouin氏液固定双肺， 放大镜下观察、计数肺结节。最后常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜观察。
结果显示MDA-MB-231/Neo细胞组6只均有肺转移，MDA-MB-231/BTG2组仅发现3 只有肺转移。肉眼观典型的肺转移为两肺分布多个大小不等的粟粒状浅黄色结节，以下肺 多见。结果见表2和图8和9。
表2MDA-MB-231细胞肺转移模型结果
权利要求
1.BTG2基因在制备抑制癌症转移药物中的应用。
2.脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2在制备抑制癌症转移药物中的用。
3.一种抑制癌症转移药物，其特征在于，所述抑制癌症转移药物的活性成分包括携带 BTG2基因的真核表达质粒。
4.根据权利要求3所述抑制癌症转移药物，其特征在于，所述携带BTG2基因的真核表 达质粒为真核表达质粒pcDNA3-BTG2。
全文摘要
本发明属于基因药物领域，具体涉及BTG2基因(B细胞迁移基因2)在制备抑制癌症转移药物中的应用。本发明将脂质体介导的真核表达质粒pcDNA3-BTG2导入肿瘤细胞，使BTG2基因在肿瘤细胞中表达，然后BTG2基因通过抑制肿瘤细胞周期进程和影响细胞周期进程和细胞转移相关蛋白的表达，抑制了肿瘤细胞的远处转移能力。
文档编号A61K48/00GK102028956SQ20101058573
公开日2011年4月27日 申请日期2010年12月13日 优先权日2010年12月13日
发明者樊赛军, 胡旭东 申请人:苏州大学