专利名称：谷氨酰胺酰基环化酶效应物和谷氨酸环化酶效应物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及谷氨酰胺酰基环化酶(glutaminyl cyclase) (QC，EC2. 3. 2. 5)，其催化 N-末端谷氨酰胺残基转化为焦谷氨酸(5-氧代-脯氨酸，pGlu*)同时释放氨的分子内环化反应和N-末端谷氨酸残基转化为焦谷氨酸同时释放水分子的分子内环化反应。本发明确认了哺乳动物的QC为金属酶，提供了新型的哺乳动物QC的生理底物、新型的QC效应物、以及QC效应物和包含QC效应物的药物组合物用于治疗可通过调节QC活性而治疗的疾病中的用途。此外，已发现金属相互作用(metal interaction)是开发QC抑制剂的一种有效途径。在一个优选的具体实施方案中，本发明提供将QC活性的效应物与DP IV或DP IV 样酶(DP IV-Iike enzyme)的抑制剂相联合用于治疗或减轻可通过调节QC活性和/或DP IV活性而治疗的疾病中的用途。本发明还提供一种鉴定和选择QC活性的效应物的筛选方法。
背景技术：
谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC 2. 3. 2. 5)催化N-末端谷氨酰胺残基转化为焦谷氨酸(pGlu*)同时释放氨的分子内环化反应。1963年，Messer首次由热带植物番木瓜 (Carica papaya)胶乳中分离得到 QC(Messer，M. 1963 Nature 4874,1299)。24 年后，在动物垂体中发现了一种相应的酶活性(Busby，W. H. J.等，1987 J Biol Chem 262,8532-8536 ； Fischer ；W. H.和 Spiess，J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84,3628-3632)。对于哺乳动物的QC，通过QC的Gln至pGlu的转化可见于TRH和GnRH前体(Busby，W. H. J.等，1987 J Biol Chem 262,8532-8536 ；Fischer,W.H.和 Spiess，J. 1987 Proc Natl Acad Sci U S A 84,3628-3632)。此外，最初的QC定位试验显示其与催化作用的推定的(putative)产物共存于牛垂体中，进一步提高所提出的于肽类激素合成中的功能(Bockers，Τ. Μ.等，1995 J Neuroendocrinol 7,445-453) 0相反，植物QC的生理功能较不明显。就来自番木瓜的酶而言，据认为其在植物防御病原微生物中具有一定作用(EI Moussaoui, Α.等，2001 Cell Mol Life Sci 58,556-570)。最近通过序列对比确定了来自其它植物的推定的QC(Dahl， S. W.等，2000Protein Expr Purif 20,27-36) 然而，这些酶的生理功能仍然不明确。来自植物和动物的已知QC在底物的N-末端部位对L-谷氨酰胺有严格的特异性， 并且发现它们的动力学行为符合Michaelis-Menten方程(Pohl，T.等，1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88,10059-10063 ；Consalvo, A. P.等，1988 Anal Biochem 175,131-138 ； Gololobov, M. Y.等，1996 BiolChem Hoppe Seyler 377,395-398)。然而，对比来自番木瓜的QC和来自哺乳动物的高度保守的QC的一级结构却并未发现任何序列同源性(Dahl， S. W.等，2000 Protein Expr Purif20，27-36)。尽管植物的QC似乎属于一类新的酶家族(Dahl，S.W.等，2000 Protein Expr Purif20，27-36)，但发现哺乳动物的QC与细菌氨肽酶具有显著的序列同源性(Bateman, R. C.等，2001 Biochemistry 40，11246-11250)，从而得出植物和动物的QC具有不同的进化起源的结论。EP 020 11349. 4公开了编码昆虫谷氨酰胺酰基环化酶的多核苷酸，及其所编码的多肽。该申请进一步提供包含表达载体的宿主细胞，该表达载体包含本发明的多核苷酸。所分离的多肽和包含昆虫QC的宿主细胞可用于筛选降低谷氨酰胺酰基环化酶活性的药物的方法中。据记载，这种药物可用作杀虫剂。阿尔茨海默症(AD)是以与营养不良的(dystrophic)神经元、反应性星形胶质细胞以及小胶质细胞紧密相关的细胞外淀粉样斑块(amyloidotic plaque)的异常堆积为特征(Terry，R. D.和 Katzman，R. 1983Ann Neurol 14，497-506 ；Glenner, G. G.禾口 Wong, C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120,885-890 ；Intagaki, S. φ,1989 J Neuroimmunol 24,173-182 ；Funato, H.等，1998 Am J Pathol 152，983-992 ;Selkoe， D. J. 2001Physiol Rev 81,741-766)。β 淀粉样(Amyloid-β，A β )肽是老年斑的主要成分，并且被认为与AD发病机理及进展直接相关，该假设得到遗传学研究的支持(Glermer， G.G.和 Wong，C. W. 1984 Biochem Biophys Res Comm 120,885-890 ；Borchelt, D. R.等， 1996 Neuron 17,1005-1013 ；Lemere, C. A.等，1996 Nat Med 2,1146-1150 ；Mann, D. Μ.禾口 Iwatsubo,T. 1996 Neurodegeneration 5,115-120 ；Citron,Μ. φ,1997 Nat Med 3,67-72 ； Selkoe，D. J. 2001 physiol Rev 81，741-766)。A β 是由 β-淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白水解生成(Kang, J.等，1987 Nature 325，733-736 ;Selkoe，D. J. 1998 Trends Cell Biol 8，447-453)，即APP通过β-分泌酶在A β的N-末端和γ-分泌酶在A β的C-末端的顺序切割(Haass, C.和 Selkoe，D. J. 1993 Cell 75，1039-1042 ；Simons,Μ.等，1996 J Neurosci 16899-908)。除了在N-末端始于L-Asp的优势A β肽(Α β-1-42/40)之外，老年斑中存在很多异质性N-末端截短的形式。据报道这种被截短的肽在体外具有更强的神经毒性并且比全长的同工型更迅速聚集(Pike，C. J.等，1995 J Biol Chem 27023895-23898)。 已知N端截短的肽是在早期发作的家族性AD(FAD)患者中过度产生(Saido，Τ. C.等， 1995 Neuron 14，457-466 ;Russo，C.等，2000 Nature 405，531-532)，并已知在唐氏综合征(DS)患者的脑中于早期出现并且随年龄增长而增加(Russo，C.等，1997 FEBS Lett 409,411-416，Russo，C.等，2001 Neurobiol Dis 8,173-180 ；Tekirian, T. L.等，1998 J Neuropathol Exp Neurol 57，76_94)。最后，其量反映了疾病进行性的严重程度(Russo， C.等，1997 FEBS Lett 409，411-416)。额外的翻译后过程可能通过1位与7位天冬氨酸的异构化或外消旋化以及残基3位和11位的谷氨酸的环化进一步修饰N-末端。3位含焦谷氨酰胺的同工型[pGlu3]Ai3 (3-40/42)代表老年斑中N-端截短的物质的显著形
式-大约占 Αβ 总量的 50% (Mori,H.等，1992 J Biol Chem 267，17082-17086，Saido，
Τ. C.等，1995 Neuron 14,457-466 ；Russo, C.等，1997 FEBS Lett 409,411-416 ；Tekirian, T.L.等，1998 J Neuropathol Exp Neurol 57,76-94 ；Geddes, J. W.等，1999 Neurobiol Aging 20,75-79 ；Harigaya, Y.等，2000 Biochem Biophys Res Commun 276,422-427), 并且它们同样存在于前淀粉样病变(pre-amyloid lesion)中(Lalowski, Μ.等，1996 J Biol Chem 271,33623-33631)。[pGlu3]Aβ (3-40/42)肽的堆积很可能是由于增强聚集和赋予对大多数氨肽酶的抵抗性的结构修饰所致(Saido，T. C.等，1995 Neuron 14，457-466;Tekirian, Τ. L.等，1999 J Neurochem 73,1584-1589)。该证据为 AD 发病机理中[pGlu3] Αβ (3-40/42)肽的关键作用提供了线索。然而，关于其神经毒性和聚集性方面却了解得很少(He, W.和 Barrow，C. J. 1999 Biochemistry 38，10871-10877 ；Tekirian, Τ. L.等，1999 J Neurochem 73，1584-1589)。此外，这些同工型对神经胶质细胞的作用及神经胶质对这些肽的反应是完全未知的，不过活性神经胶质确实与老年斑有关并且可能对淀粉样沉积 (amyloid deposit)具有积极作用。在最近的研究中，在神经元和神经胶质细胞培养物中研究了 Αβ (1-42), Aβ (1-40)、[pGlu3]Ai3 (3-42)和[pGlu3]A^ (3-40)肽的毒性、聚集性以及分解代谢，表明焦谷氨酸的修饰加剧了 Αβ -肽的毒性，同时还抑制其被经培养的星形胶质细胞降解。Shirotani等人在体外研究了感染新培斯病毒(Sindbis Virus)的原代皮质神经元(primary cortical neuron)中[pGlu3]A^肽的生成。它们构建了淀粉样前体蛋白互补DNA，所述DNA编码具有氨基酸取代和缺失的[pGlu3]Ai3的潜在前体。对于始于 N-末端谷氨酰胺残基而不是天然前体中的谷氨酸的人工前体而言，提示存在自发地转化或通过谷氨酰胺酰基环化酶酶促地转化为焦谷氨酸。尚未在体内确定[pGlu3]Ai3天然前体的 3 位 N-末端谷氨酸的环化机制(Shirotani，K.，Tsubuki，S.，Lee, H. J.，Maruyama, K.， 和 Saido，T.C. (2002) Neurosci Lett 327，25-28)。
家族性英国型痴呆(FBD)和家族性丹麦型痴呆(FDD)是早期起病的常染色体显性疾病，其特征在于进行性认知障碍、强直和小脑共济失调(Ghiso，J. et al. 2000, Ann N Y Acad Sci 903,129-137 ；Vidal, R. et al. 1999, Nature 399,776-781 ；Vidal, R. et al. 2004, J Neuropathol ExpNeurol 63，787-800)。与阿尔茨海默症相似，患者体内有广泛性的实质和血管淀粉样沉积形成，伴有海马神经变性、补体和神经胶质活化(Rostagno， A. et al. 2002, J Biol Chem 277，49782-49790)。这些疾病由 BRI 基因(SwissProt Q9Y287) 的不同突变引起，这些突变产生的开放读框较野生型BRI长11个氨基酸。对于FBD，ORF 的改变由BRI (BRI-L)的终止密码子突变引起，而在FDD，一个10个核苷酸的复制插入产生了更大的 BRI (BRI-D) (Ghiso J. et al. 2001 Amyloid 8，277-284 ；Rostagno, A. etal. 2002 J Biol Chem 277，49782-49790)。BRI是2型跨膜蛋白，由13号染色体编码，已经发现其通过弗林蛋白酶(furin)和其他激素原转换酶在C端区域进行处理，释放一种长度为23 个氨基酸的肽(Kim, S. H. et al. 2000 Ann N Y Acad Sci920，93-99 ；Kim, S. H. et al. 2002 J Biol Chem 277，1872-1877)。突变的BRI蛋白BRI-D和BRI-L的裂解导致产生一些肽 (ABri和ADanJ^* 34个氨基酸)，所述的肽易于聚集，引起非纤维性沉积以及淀粉样原纤维(amyloid fibrils)(El Agnaf, 0. Μ. et al. 2004 Protein Pept Lett 11，207-212 ;E1 Agnaf, 0. Μ. et al. 2001 Biochemistry 40,3449-3457 ；El Agnaf, 0.Μ. et al. 2001 J Mol Biol 310,157-168 ；Srinivasan et al. 2003 J Mol Biol 333，1003-1023)。ADan 禾口 ABri 肽在其N端22个氨基酸是相同的，但含有不同的C端区域。C端部分被发现对于原纤维形成和神经毒性是必需的(ElAgnaf, 0. M. et al. 2004 Protein Pept Lett 11,207-212) 已经发现，ABri和ADan肽的N端通过焦谷氨酰形成(pyroglutamyl formation) 而被封闭。根据阿尔茨海默症中Αβ的N端的焦谷氨酰形成，pGlu形成于谷氨酸(Ghiso J.et al. 2001 Amyloid 8 ；Saido et al. 1995 Neuron 14，457-466)。反过来，焦谷氨酰的形成使得肽对于大多数氨肽酶的降解作用变得稳定，由此刺激了疾病的进展。已经发现，聚集物的形成在细胞外进行，但也见于细胞的分泌途径(Kim et al. 2002 J Biol Chem 277，1872-1877)。因 此，通过抑制谷氨酰胺酰基和谷氨酸环化酶而抑制在具有神经毒性的ABri 和ADan肽的N端形成pGlu，代表了一种治疗FBD和FDD的新方法。二肽基肽酶IV(DP IV)是在机体的多种组织包括肾脏、肝脏和肠中发现的在脯氨酸后(在较小程度上为丙氨酸后、丝氨酸后或甘氨酸后)进行切割的丝氨酸蛋白酶，并且可将N-末端的二肽从肽链上切割下来。最近已发现DP IV在神经肽的新陈代谢、T细胞活化、 癌细胞对内皮的附着以及HIV进入淋巴样细胞方面起着重要的作用。参见WO 02/34242、 W002/34243.W0 03/002595 以及 WO 03/002596。WO 99/61431公开的DP IV抑制剂包含一氨基酸残基和一噻唑烷或吡咯烷基团及其盐，尤其是L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、 L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷。低分子量的二肽基肽酶IV抑制剂的进一步实例为以下物质，如四氢异喹啉-3-甲酰胺衍生物、N-取代的2-氰基吡咯和2-氰基吡咯烷、N-(N'-取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷、N-(取代的甘氨酰基)-噻唑烷、N-(取代的甘氨酰基)-4-氰基噻唑烷、氨基_酰基_ 二羟硼基_脯氨酰_抑制剂、环丙基稠合的吡咯烷和杂环化合物。二肽基肽酶IV抑制剂记载于 US 6，380，398、US 6，011，155、US 6，107，317、US 6，110，949、US 6，124，305、 US 6，172，081、WO 95/15309、WO 99/61431、WO 99/67278、WO 99/67279、DE 19834591、 WO 97/40832、DE 19616486C 2、WO 98/19998、WO 00/07617, W099/3850U WO 99/46272、 WO 99/38501、WO 01/68603、WO 01/40180、WO 01/81337、WO 01/81304、WO 01/55105、WO 02/02560 以及 W002/14271、WO 02/04610、WO 02/051836、WO 02/068420、WO 02/076450、 WO 02/083128、WO 02/38541、WO 03/000180、WO 03/000181、W003/000250、WO 03/002530、 WO 03/002531、WO 03/002553、WO 03/002593、WO 03/004496、WO 03/024942 以及 WO 03/024965，其教导，尤其是涉及这些抑制剂、其定义、应用及其制备的教导全文并入此处作为参考。

发明内容
本发明提供了哺乳动物QC的新的生理底物，其选自GlU1-ABri、Glu1-ADan, Gln3-Aii (3-40/42)、和Gln1-胃泌素(17和34)，并提供了 QC效应物及包含QC效应物的药物组合物用于治疗可通过调节QC活性而治疗的疾病的应用，所述疾病优选地选自伴随或不伴随幽门螺杆菌的十二指肠癌、结直肠癌和Zolliger-Ellison综合征、家族性英国型痴呆和家族性丹麦型痴呆。通过抑制试验发现，人QC是金属依赖性转移酶。QC脱辅基酶(apoenzyme)通过锌离子可最有效地被再活化，并且锌依赖性氨肽酶的金属结合基序同样存在于人QC中。与活性位点结合金属相互作用的化合物为有效的抑制剂。出乎意料的是，研究表明重组人QC和源自脑提取物的QC活性催化N-末端谷氨酰胺酰基的环化作用以及谷氨酸的环化作用。更惊人的发现是，环化酶催化的Glu1转化在pH 6. 0左右有利，而Gln1至pGlu-衍生物的转化的最适pH在8. 0左右。由于pGlu-Αβ相关肽的形成可通过抑制重组人QC及源自猪垂体提取物的QC活性而得以抑制，因此酶QC为研发阿尔茨海默症治疗药物的靶向之一。本发明提供了用于胃肠外、肠道或口服施用的药物组合物，其包含至少一种QC效应物，所述效应物任选地与常规的载体和/或赋形剂相组合；或者其包含至少一种QC效应物，所述效应物与至少一种DP IV抑制剂相组合，且任选地与常规的载体和/或赋形剂相组合。本发明提供了可由通式1概括表示的QC抑制剂或其药用可接受的盐，包括所有的立体异构体
噻吩-2-基)丙-1-酮
8.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述QC抑制剂与至少一种常规载体和/或赋形剂相组合使用。
9.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述QC抑制剂与DPIV抑制剂相组合使用。
10.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述DPIV抑制剂选自以下一组L-苏-异亮氨酰噻唑烷、L-别-异亮氨酰噻唑烷、L-苏-异亮氨酰吡咯烷、L-别-异亮氨酰吡咯烷、 NVP-DPP728A (1- [ [ [2- [ {5-氰基吡啶_2_基}氨基]乙基]氨基]乙酰基]_2_氰基-(S)-吡咯烷)、LAF-237(l-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷_2 (S)-腈)、 TSL-225(色氨酰基-1，2，3，4-四氢异喹啉_3_羧酸)、FE-999011、N-缬氨酰-脯氨酰、 0-苯甲酰羟胺、丙氨酰吡咯烷、H-Asn-吡咯烷、H-Asn-噻唑烷、H-Asp-吡咯烷、H-Asp-噻唑烷、H-Asp (NHOH)-吡咯烷、H-Asp (NHOH)-噻唑烷、H-Glu-吡咯烷、H-Glu-噻唑烷、 H-Glu(NHOH)-吡咯烷、H-Glu(NHOH)-噻唑烷、H-His-吡咯烷、H-His-噻唑烷、H-Pro-吡咯烷、H-Pro-噻唑烷、H-Ile-吡咯烷、H-L-别-Ile-噻唑烷、H-Val-吡咯烷和H-Val-噻唑烷、2-氨基辛酸-Pro-lie、Abu-Pro-IIe> Aib_Pro_Ile、Aze_Pro_Ile、Cha_Pro_Ile、 IIe-Hyp-IIe> lie-Pro-另lj -lie、lie-Pro-叔丁 基-Gly、Ile-Pro-VaU Nle-Pro-Ile、 Nva-Pro-IIe>Orn-Pro-IIe>Phe-Pro-IIe>Phg-Pro-IIe>Pip-Pro-IIe> Ser (Bzl)-Pro-IIe> Ser (P)-Pro-lie, Ser-Pro-Ile、叔丁 基-Gly-Pro-D-Val、叔丁 基-Gly-Pro-Gly、叔丁 基-Gly-Pro-Ile,叔丁 基-Gly-Pro-Ile-酰胺、叔丁 基-Gly-Pro-叔丁 基-Gly, 叔丁基-Gly-Pro-Val、Thr-Pro-Ile、Tic-Pro-Ile、Trp-Pro-Ile、Tyr (P)-Pro-lie、 Tyr-Pro-别-lie、Val-Pro-别-lie、Val-Pro-叔丁基-Gly、Val-Pro-Val、或它们的药物学可接受的盐。
11.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述DPIV抑制剂选自以下一组2_甲基羰基-I-N- [ (L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，2-甲基羰基-I-N- [ (L)-缬氨酰-(L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]_(2S)_吡咯烷氢溴酸盐，2-[(乙酰基-氧-甲基)羰基]-I-N- [ (L)-丙氨酰-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，2-[(苯甲酰-氧-甲基) 羰基]-I-N-[ {(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷氢溴酸盐，2-{[ (2，6- 二氯苄基) 硫甲基]羰基}-l-N-[{(L)_丙氨酰}-(L)_缬氨酰]_(2S)_吡咯烧，2-[(苯甲酰-氧-甲基)羰基]-I-N-[甘氨酰-(L)-缬氨酰]_(2S)_吡咯烷氢溴酸盐，2-[([1，3]_噻唑噻唑-2-基)羰基]-I-N- [ {(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，2_ [(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-I-N- [N- {(L)-丙氨酰} - (L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，2-[(苯并噻唑噻唑-2-基)羰基]-I-N- [ {(L)-丙氨酰}-甘氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐，2-[(吡啶-2-基)羰基]-I-N-[N-{(L)-丙氨酰}-(L)-缬氨酰]-(2S)-吡咯烷三氟乙酸盐、1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2-戊烷氯化铵，1-环戊基-3-甲基-1-氧代-2- 丁烷氯化铵，1-环戊基-3，3-二甲基-1-氧代-2-丁烷氯化铵，1-环己基-3，3-二甲基-1-氧代-2- 丁烷氯化铵，3-(环戊基羰基)-1，2，3，4-四氢异喹啉氯化物，和N- (2-环戊基-2-氧乙基)环己烷氯化铵，或它们的其它药物学可接受的盐。
12.权利要求1至5中任一项的用途，其特征在于所述QC抑制剂与DPIV样酶抑制剂相组合使用，其中所述DP IV样酶选自成纤维细胞激活蛋白α、二肽基肽酶IV β、二肽基氨肽酶样蛋白、N-乙酰化的α-连接的酸性二肽酶、休眠细胞脯氨酸二肽酶、二肽基肽酶 II、吸诱素和二肽基肽酶IV相关蛋白(DPP 8)、DPL1(DPX，DP6)、DPL2、DPP 9和二肽基肽酶 10。
13.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述QC抑制剂是竞争性抑制剂。
14.权利要求1-5中任一项的用途，其中所述谷氨酰胺酰基环化酶抑制剂与谷氨酰胺酰基环化酶的活性位点结合金属离子相互作用。
15.权利要求1-5中任一项的用途，用于胃肠夕卜、肠道或口服施用。
16.权利要求1-5中任一项的用途，用于口服施用。
全文摘要
本发明提供了哺乳动物谷氨酰胺酰基环化酶(QC，EC 2.3.2.5)的新生理底物、QC的新效应物、筛选该效应物的方法、该效应物以及包含该效应物的药物组合物在治疗可通过调节QC活性治疗的疾病中的应用。优选的组合物还包括DP IV或DP IV样酶抑制剂以治疗或减轻可通过调节QC和DP IV活性治疗的疾病。
文档编号A61K31/00GK102302781SQ201110259708
公开日2012年1月4日 申请日期2004年10月15日 优先权日2003年10月15日
发明者乌尔里希·海泽, 安德烈·约翰内斯·尼斯特罗杰, 托尔斯滕·霍夫曼, 斯特凡·席林, 汉斯-乌尔里希·德穆特 申请人:前体生物药物股份公司