专利名称：用家蚕丝素蛋白与贝壳粉末制备人工骨的方法
技术领域：
本发明涉及生物组织工程及生物材料技术领域，特别是涉及一种人工骨的制备方法， 具体说是一种以家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白与贝壳粉末为材料制备人工骨的方法。
背景技术：
天然蚕丝由丝素蛋白与丝胶蛋白组成，其中，由于丝胶蛋白具有免疫原性，故限制了 蚕丝在生物组织工程领域的广泛应用，因此，蚕丝在生物组织工程领域的应用中，通常是 以蚕丝脱胶的方法制备丝素蛋白。目前的脱胶工艺很难完全去除蚕丝中的丝胶蛋白，也就 是说，目前所采用的以蚕丝脱胶的方法所制备的丝素蛋白中必定有丝胶蛋白残留。材料的 免疫原性问题是组织工程材料首先要避免的问题，所以，很有必要采用其他方法获取没有 残留丝胶蛋白的丝素蛋白。有鉴于此，人们开始直接从家蚕的后部丝腺获取丝素蛋白，这 种方法获得的丝素蛋白中不含丝胶。这是因为，在家蚕体内，丝胶位于家蚕的中部丝腺， 丝素蛋白位于家蚕的后部丝腺，家蚕吐丝时，后部丝腺中的丝素蛋白经过中部丝腺并被丝 胶包裹后，经吐丝管压丝区的挤压最终形成天然蚕丝。
直接从家蚕后部丝腺提取丝素蛋白的方法由于可以获得不含有丝胶蛋白的丝素蛋白 而具有其先进性。
丝素蛋白由于具有良好的生物相容性而被广泛应用于组织工程领域，如人工血管、人 工神经、人工韧带等。但是，丝素蛋白本身并不是一种十全十美的生物材料，所以，在通 常情况下，丝素蛋白需要与其他材料进行复合以制备复合材料，以满足组织工程领域不同 研究及应用的需要。但是，到目前为止，用取自家蚕后部丝腺的丝素蛋白与贝壳粉末进行 复合以制备人工骨的研究还未见报道。

发明内容
本发明的目的在于提供一种人工骨的制备方法，该方法以家蚕后部丝腺来源的丝素蛋 白与贝壳粉末为材料制备。
本发明依次通过下列步骤实现 (1)后部丝腺来源丝素蛋白粉末的制备
取家蚕五龄幼虫，取出后部丝腺，放入水相介质中，0-4'C下摇床或其他震动方式处 理6 12小时，过滤，制得丝素蛋白水相介质溶液，冷冻干燥后机械粉碎，筛分备用；(2) 贝壳粉末的制备 将背角无齿蚌贝壳去角质层，机械粉碎，筛分备用；
(3) 人工骨的制备
将丝素蛋白及贝壳粉末按1: 9 9: 1的质量比进行配伍，将此混合物在水相介质中
进行物理共混，在模具中成型，冷冻干燥后，在烘箱中6(TC条件下烘5分钟，反复烘4 5 次，即获得人工骨。
上述方法中，冷冻干燥为现有技术，冷冻温度一般为-80'C,冷冻时间为20小时。 本发明方法获得的人工骨为质地均一的蜂窝状，孔隙率8-50%，孔径10-100微米，弯 曲模量50-1000MPa,压縮模量100-1200MPa，拉伸强度为1-100 MPa。同时，本发明方法 所制备的人工骨的孔隙率、孔径大小及生物力学参数等，可以根据丝素蛋白及贝壳粉末的 比例进行调节。
本发明的优点是
本发明方法所制备的人工骨的孔隙率、孔径大小及生物力学参数等，可以根据丝素蛋 白及贝壳粉末的比例进行调节，也可以通过人工骨的成型工艺来进行调节。因此，其压縮、 弯曲、拉伸力学测试结果可以分别满足人松质骨或密质骨的要求；其形态及几何尺寸可以 根据临床需求而改变，生物安全性符合国颁标准；本人工骨在30-160摄氏度范围内，内部 结构稳定，也就是说，在人体温度及湿热灭菌温度范围内，其内部结构稳定。因此，本人 工骨对矫形外科临床需求的适应范围较广。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发明， 而不构成对本发明的限定。
实施例l:柱状密质骨型人工骨制备
(1) 后部丝腺来源丝素蛋白粉末的制备
取家蚕五龄幼虫，取出后部丝腺，放入水相介质中，0-4"C下摇床处理6小时，过滤， 制得丝素蛋白水相介质溶液，冷冻干燥后机械粉碎，筛分备用；
(2) 贝壳粉末的制备 将背角无齿蚌贝壳去角质层，机械粉碎，筛分备用；
(3) 人工骨的制备
将丝素蛋白及贝壳粉末按1: 9的质量比进行配伍，将此混合物在水相介质中进行物
理共混，在模具中成型，冷冻干燥后，在烘箱中6(TC条件下烘5分钟，反复烘4次，即获得人工骨。
冷冻干燥温度-80。C ，冷冻时间为20小时。
本柱状密质骨型人工骨的几何形态及尺寸
纺锤型，中空，两端封闭，长3-50厘米，外径1-6厘米，内径0. 5-5厘米，壁厚0. 2-3 厘米，骨干及骨端质地均一，均为蜂窝状结构。 性能检测
(1) 采用扫描电镜观察其断面结构。
(2) 孔隙率的测定
采用比重法，在室温条件下测定选用一个比重瓶，加满蒸馏水并称质量(M1);把质
量为Ms的样品浸入蒸馏水中，抽真空，使样品中的气体完全被蒸馏水取代，待比重瓶补
满蒸馏水后称质量(M2);将浸透了蒸馏水的样品取出，称剩余的蒸馏水与比重瓶的质量
(M3)。
计算公式e = (M2 - M3 - Ms) / (Ml - M3) X 100 %
(3) 力学性能检测
将样品在CMT6503型微机控制电子万能试验机上测试弯曲模量、压縮模量和拉伸强度， 加载速度为lmm/min。
(4) 红外光谱检测
将样品用KBr压片。采用傅立叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)测定其在波数 4000 400cm-1的吸收光谱。
(5) DSC热分析检测
取样品若干克，研磨，筛分(200目)，备用。用STA409PC型差热分析仪对样品在加热 过程中的相变温度(DSC)进行分析，分析条件为在氩气保护气氛中以10K/min的加热速率 进行升温原材料混合粉末从30。C加热至60(TC;样品粉末从30'C加热至160°C。
(6) 生物安全性检测
① 供试液准备
取样品lg,生理盐水中下浸提24h (37土rC)，常温下8000rpm离心5min，取上清 液作为供试液备用，并将生理盐水作为对照。
② 过敏性试验
随机抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七组，分别用已配制好的7种供试液，对七 组小白鼠进行腹腔注射，观察15min内小白鼠有无爪搔鼻、喷嚏、竖毛、干呕或咳嗽三声以上、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡等反应，并记录结果；第3天，进行第 二次腹腔注射；第5天，进行第三次腹腔注射；第14天，进行第一次尾静脉攻击，观察 15min内小白鼠的反应，并记录结果；第15天、第16天、第17天陆续完成静脉注射；第 19天，进行第二次尾静脉攻击。如两次攻击小白鼠均未出现明显的上述过敏现象，即可认 为受试品不会引起过敏反应。
③ 动物急性(单剂量)毒性
随机抽取32只小白鼠，雌雄各半，分成八组，分别用已配制好的7种供试液对七组 小白鼠进行静脉注射，另外一组用生理盐水作阴性对照。观察小白鼠的生长情况，并记录 小白鼠的体重。
④ 皮肤刺激试验
随机抽取28只小白鼠，雌雄各半，分成七组，分别用已配制好的7种供试液对七组 小白鼠进行试验。在脊柱两侧各选3个2 3cm3面积的去毛区，将试验样品斑贴，左侧3 点为供试液，右侧3点为生理盐水，用4层25mmX25mm纱布覆盖，包扎固定。4h后除去 斑贴物，并标记斑贴部位，用温水或70%乙醇清洁后吸干，观察斑贴部位的反应。每12h 重复一次，连续7天，后续观察7天，并记录结果。
⑤ 溶血试验
取2.0士0.2kg的白兔l只，自心脏取血20ml，用玻璃棒搅拌除去血块，加入生理盐 水7ml，肝素lml，混合后4。C下，2200rpm，离心10min，分离，弃去上清，用生理盐水反 复离心清洗，直至上清不呈红色，然后按所得红细胞容积，用生理盐水配成2%的悬液，即 用移液枪按0.2ml:9.8ml (血细胞生理盐水)的比例配置。
添加顺序供试液、生理盐水，37。C水浴10min， 2%红细胞悬液，37"水浴，观察15min， 结果无棕色絮状沉淀；然后1000rpm， 5min离心，取上清液，用UV-2100分光光度计测 定各吸收值，以生理盐水为对照。
结果显示内部结构为质地均一的蜂窝状，孔隙率8-15%;孔径10-30微米，弯曲模 量800-1000MPa，压縮模量800-1200MPa，拉伸强度为80-100 MPa;红外特征谱带显示， 其分子形态基本是无规巻曲结构；DSC检测表明在16(TC的温度范围内只有水分的挥发，没 有发生相的变化；生物安全性测试表明，样品的安全性指标合格。
实施例2:板状密质骨型人工骨制备 (1)后部丝腺来源丝素蛋白粉末的制备
取家蚕五龄幼虫，取出后部丝腺，放入水相介质中，0-4"C下震动处理9小时，过滤，
6制得丝素蛋白水相介质溶液，冷冻干燥后机械粉碎，筛分备用；
(2) 贝壳粉末的制备 将背角无齿蚌贝壳去角质层，机械粉碎，筛分备用；
(3) 人工骨的制备
将丝素蛋白及贝壳粉末按1: 1的质量比进行配伍，将此混合物在水相介质中进行物 理共混，在模具中成型，冷冻干燥后，在烘箱中60'C条件下烘5分钟，反复烘5次，即获
得人工骨。
冷冻干燥温度-80°C ，冷冻时间为20小时。
本板状密质骨型人工骨的几何形态及尺寸
板状，长1-10厘米，宽l-5厘米，厚0.5-1厘米，内部质地均一，为蜂窝状结构。 性能检测同实施例1
结果显示内部结构为质地均一的蜂窝状，孔隙率15-30%;孔径30-60微米，弯曲模 量400-800MPa，压縮模量400-800MPa，拉伸强度为40-80 MPa;红外特征谱带显示，其分 子形态基本是无规巻曲结构；DSC检测表明在16(TC的温度范围内只有水分的挥发，没有发 生相的变化；生物安全性测试表明，样品的安全性指标合格。
实施例3:块状松质骨型人工骨制备
(1) 后部丝腺来源丝素蛋白粉末的制备
取家蚕五龄幼虫，取出后部丝腺，放入水相介质中，0-4'C下摇床处理12小时，过滤， 制得丝素蛋白水相介质溶液，冷冻干燥后机械粉碎，筛分备用；
(2) 贝壳粉末的制备
将背角无齿蚌贝壳去角质层，机械粉碎，筛分备用；
(3) 人工骨的制备
将丝素蛋白及贝壳粉末按9: 1的质量比进行配伍，将此混合物在水相介质中进行物
理共混，在模具中成型，冷冻干燥后，在烘箱中6(TC条件下烘5分钟，反复烘5次，即获 得人工骨。
冷冻干燥温度-80°C，冷冻时间为20小时。 本块状松质骨型人工骨的几何形态及尺寸
块状，长5-IO厘米，宽5-IO厘米，厚5-IO厘米，内部质地均一，为蜂窝状结构。 性能检测同实施例l
结果显示内部结构为质地均一的蜂窝状，孔隙率30-50%;孔径60-100微米，弯曲模量50-400MPa，压縮模量100-400MPa，拉伸强度为卜40 MPa;红外特征谱带显示，其分 子形态基本是无规巻曲结构；DSC检测表明在16(TC的温度范围内只有水分的挥发，没有发 生相的变化；生物安全性测试表明，样品的安全性指标合格。
权利要求
1、一种用家蚕丝素蛋白与贝壳粉末制备人工骨的方法，其特征在于，依次通过下列步骤实现(1)后部丝腺来源丝素蛋白粉末的制备取家蚕五龄幼虫，取出后部丝腺，放入水相介质中，0-4℃下摇床或其他震动方式处理6～12小时，过滤，制得丝素蛋白水相介质溶液，冷冻干燥后机械粉碎，筛分备用；(2)贝壳粉末的制备将背角无齿蚌贝壳去角质层，机械粉碎，筛分备用；(3)人工骨的制备将丝素蛋白及贝壳粉末按1∶9～9∶1的质量比进行配伍，将此混合物在水相介质中进行物理共混，在模具中成型，冷冻干燥后，在烘箱中60℃条件下烘5分钟，反复烘4～5次，即获得人工骨。
全文摘要
一种用家蚕丝素蛋白与贝壳粉末制备人工骨的方法，以家蚕后部丝腺来源的丝素蛋白与贝壳粉末为材料制备。所制备的人工骨的孔隙率、孔径大小及生物力学参数等，可以根据丝素蛋白及贝壳粉末的比例进行调节，也可以通过人工骨的成型工艺来进行调节，在30-160摄氏度范围内，内部结构稳定，其生物安全性符合国颁标准。因此，所制备的人工骨对矫形外科临床需求的适应范围较广。
文档编号A61L27/22GK101549173SQ200910103809
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者代时春, 佳 刘, 彬 刘, 水 徐, 惠 李 申请人:西南大学