专利名称：环脂肽类抗生素及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的环脂肽类抗生素一环九肽菌素及其制备与应用，属于生物医学技术领域。
背景技术：
由于抗生素的广泛应用或滥用，使得一度在细菌感染性疾病治疗中起着显著作用的抗生素出现了广泛的失效。许多常见细菌对常用抗生素的耐药性不断增强。目前，细菌耐药性已经严重威胁人类的健康。耐甲氧西林金黄葡萄球菌，耐青霉素肺炎链球菌以及产超广谱内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌和克雷伯菌等多重耐药菌已成为医院中传播率和致死率很高的病原体。耐万古霉素肠球菌(VRE)的快速出现，加剧了人们对致病菌耐药性问题的担心。另外，随着免疫抑制剂和广谱抗生素的广泛应用，导管、插管、烧伤抢救、放化疗和 器官移植的推广，真菌感染的发病率也逐年增加。据不完全统计，近10年来，全身性真菌感染的发病率增加了 3 5倍，而且预后差、死亡率高。根据化学结构，可将上市的抗真菌药分为四大类丙烯类(特比萘芬)、多烯类(两性霉素B等)、唑类(伊曲康唑等)、棘白霉素类(卡泊芬净)等。特比萘芬疗效低，不能单独给药；多烯类有严重的不良反应；唑类仅能抑制而不能杀灭真菌；棘白霉素类虽然对于念珠菌属以及曲霉菌属均有效，而且安全性较高，但却面临尚无口服剂型和价格昂贵等两大问题，故而限制了它们在临床上的应用。鉴于此，寻找结构新颖、不易产生交叉耐药以及适合工业化生产的新型抗生素将是人类面临的一项长期而艰巨的任务。

发明内容
本发明的目的是克服上述不足之处，提供一种针对临床耐药致病菌，具有潜在医疗应用价值的新的脂肽类抗生素——环九肽菌素的制备方法与应用。按照本发明提供的技术方案，一种环脂肽类抗生素，结构简式如下
权利要求
1.一种环脂肽类抗生素，其特征是结构简式如下
2.一株制备环脂肽类抗生素的菌株，其特征是所述菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus ehirnensis strain B7),保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2012年6月24日，地址中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO M 2012244。
3.环脂肽类抗生素的制备方法，其特征是步骤为 (1)培养发酵将类芽抱杆菌(Paenibacillusehirnensis strain B7)接种到发酵培养基，得到活化菌株，活化菌株在种子培养基中振荡培养两次，得到二级种子液，二级种子液接入发酵培养基中振荡培养发酵，得到发酵液，离心、取发酵液上清，去沉淀，先经大孔吸附树脂吸附，将发酵上清以合适速度流经用蒸馏水平衡好的、装填有大孔吸附树脂的层析柱； (2)分离纯化待样品上完后,先分别用蒸馏水和甲醇水溶液冲洗,然后用甲醇水溶液洗脱；收集各洗脱峰，测活，将活性组分浓缩蒸干得到粗品；将粗品用甲醇溶解，离心过滤，用固相萃取柱进一步纯化；再用制备型高效液相色谱进行精纯，收集活性组分，浓缩、冻干即可得到所述环九肽菌素。
4.如权利要求3所述环脂肽类抗生素的制备方法，其特征是具体步骤为 (1)将保存于-80V冰箱的甘油管中的类芽孢杆菌(Paenibacillus ehirnensisstrain B7)转接到营养琼脂培养基上，28 35°C培养24 96h，得到活化菌株； 营养琼脂培养基，按如下组成配制牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水IOOOmL, pH7. 2 ； (2)将活化菌株接入盛于250mL三角瓶的50mL种子培养基中，于28 35°C，220rpm振荡培养24h，即为一级种子液； (3)将步骤(2)所得的一级种子液接入盛于500mL三角瓶的200mL种子培养基中，于·28 35°C，220rpm振荡培养24h，即为二级种子液； 种子培养基为营养肉汤培养基，按如下组成配制牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，自来水 IOOOmL, ρΗ7· 2 ； (4)将步骤(3)所得的二级种子液按体积比5% 10%的接种量接入含500mL发酵培养基的2L三角瓶中，于28 35°C，200rpm振荡培养96h，获得发酵液； 发酵培养基按如下组成配制:葡萄糖，O 10g/L ；CaCl2,0. 01 O. 7g/L ；MgS04 · 7H20，·0. 05 lg/L ；ZnS04,0 . 00 5 0. lg/L ；NaCl,0. 05 0. 5g/L ;FeS04,0 . 00 5 0. 05g/L ；(NH4)2SO47O. 5 4. Og/L ；MnS04 · H20,0. 001 0. Olg/L ；KH2PO4, 0. 5 5g/L ;溶剂为蒸馏水，pH 7· 0 7· 5 ; (5)步骤(4)取得的发酵液转到离心瓶中，平衡后于6500X g离心30min，去除沉淀，得澄清发酵上清液； (6)将步骤(5)所得的上清液以10 50mL/min的流速流穿用蒸馏水平衡好的Amberlite XAD-16层析柱，待样品上完后分别用蒸馏水及含体积比为45%的甲醇的水溶液各冲洗5个床体积，然后用含体积比为90%的甲醇的水溶液洗脱，收集体积比为90%的甲醇水溶液洗脱的洗脱峰，55 65°C浓缩蒸干，得到粗品I ; (7)将粗品I用甲醇溶解，用O.45 μ m的滤膜过滤后上样至用体积比25%的乙腈水溶液平衡好的C-18固相萃取柱，样品加完后再用体积比为25%的乙腈水溶液冲洗5个床体积，然后用体积比65%的乙腈水溶液洗脱，收集洗脱峰，浓缩蒸干，得到粗品2 ； (8)将粗品2用甲醇溶解、12000rpm离心lOmin，并过O.45μΜ滤膜后，用制备型HPLC进行分离；分离后A液为含体积比O. 1%三氟乙酸的水溶液，B液为色谱纯乙腈；洗脱梯度为在40min时间里B液从体积比15%提高到60% ;收集活性部分，55 65 °C浓缩、-50°C _60°C真空冷冻干燥，即得产品环脂肽类抗生素。
5.如权利要求4所述环脂肽类抗生素的制备方法，其特征是所述发酵培养基为葡萄糖，3. 5g/L ；CaCl2,0. 05g/L ；MgS04 · 7Η20，0· lg/L ；ZnS04,0. Olg/L ；NaCl,0. 3g/L ；FeS04,0. Olg/L ； (NH4)2SO4, 2. 5g/L ；MnSO4 · H20,0. 004g/L ；KH2PO4, 2. 5g/L ;溶剂为水，pH 7. 0 7. 2。
6.环脂肽类抗生素的应用，其特征是环脂肽类抗生素能够用于制备抗细菌感染药物。
7.如权利要求6所述环脂肽类抗生素的应用，其特征是环脂肽类抗生素用于制备抗多重耐药细菌所致感染的药物。
8.如权利要求7所述环脂肽类抗生素的应用，其特征是环脂肽类抗生素用于制备抗多重耐药革兰氏阴性菌所致感染的药物。
全文摘要
本发明涉及一种新的环脂肽类抗生素—环九肽菌素及其制备与应用，属于生物医学技术领域。其将类芽孢杆菌接种到发酵培养基，于28~35℃下培养24~96h，离心、取发酵液上清，先经大孔吸附树脂吸附，然后经进一步分离纯化得到所述环脂肽类抗生素，可应用于制备抗细菌感染药物。本发明提供了一种毒性优于多粘菌素B、具有较高医疗应用价值的环九肽菌素及其制备方法和应用，体外实验表明该化合物对所有测试过的革兰氏阳性和阴性致病菌，包括多重耐药以及超级耐药菌，均具有显著的抑制作用；体内实验表明该化合物对超广谱耐药铜绿假单胞引起的小鼠败血症具有明显的防治效果。
文档编号A61K38/08GK102911257SQ20121035678
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月21日 优先权日2012年9月21日
发明者黄朝晖 申请人:无锡市第四人民医院