专利名称：猪流行性腹泻S₁蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪流行性腹泻S1蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本发明进一步涉及含有该表达载体的重组巨大芽孢杆菌菌株以及它们在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的应用，属于猪流行性腹泻的防治领域。
背景技术：
猪流行性腹泻(PEDV)是由冠状病毒引起猪的一种急性高度接触性传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，该病在世界范围内广泛分布，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗PEDV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。PEDV具有典型的冠状病毒结构，由4种主要结构蛋白组成，分别为磷酸化的核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、糖基化的纤突蛋白(S)和小囊膜蛋白(E)其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白，因此，S蛋白对病毒感染、发挥其致病性和决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。PEDV感染具有明显的嗜肠性，分泌型IgA抗体是保护猪体不受PEDV感染和免于发病的关键因素，口服免疫后，在肠液和血清中均可检出SlgA抗体，而非口服途径接种则检测不到slgA。仔猪可通过初乳获得母源slgA，产生对流行性腹泻的被动免疫保护。常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对猪流行性腹泻的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为关键。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白；本发明的目的之二是提供含有上述猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因的表达载体；本发明的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由PEDV糖蛋白S的S1抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)连接得到的融合基因，其多核苷酸序列为SEQ ID No. 1 所示。本发明根据Genbank登录的PEDV全基因序列AF353511，找出编码S糖蛋白的 22-505aa段序列，通过柔性的Linker ((GGGGS) 3)将PEDV的S1抗原位点基因和细胞壁锚定序列(CWAm6)连接起来，将该序列命名为MLSJSEQ ID No. 1)。考虑到巨大芽孢杆菌密码子的偏嗜情况，本发明为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子苏氨酸(ACG)、组氨酸(CAC)、精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等进行改变。此外，在MLS1的上游和下游分别引入Bgl II酶切位点和SphI 酶切位点。本发明的另一方面是提供由SEQ ID No. 1所示融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No. 2所示。。本发明的又一方面是提供含有所述猪流行性腹泻S1蛋白融合基因的表达载体；例如，将本发明SEQ ID No. 1所示的抗原融合基因与表达载体PHIS1525进行可操作性的连接，得到可以在巨大芽孢杆菌的外表面或其细胞壁表达融合基因的分泌表达载体。针对PEDV经黏膜感染和SlgA在抵抗疾病中具有重要作用的特点，本发明构建了表达PEDV S1蛋白的重组巨大芽孢杆菌表达系统，作为一种口服疫苗，通过刺激肠道黏膜免疫系统产生的特异性slgA，达到阻止病原感染的目的。由此，本发明的再一方面是提供一株表达猪流行性腹泻Sl蛋白融合基因的重组巨大芽孢杆菌菌株，能够用其制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本发明将SEQ ID No. 1所示的融合基因与分泌表达载体pHIS1525进行双酶切、连接并经原生质体转化转入宿主菌巨大芽孢杆菌WH320细胞，获得含有重组质粒的重组巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株(WHSZO-pHISlSZS-MLSi)；其微生物保藏号是CCTCC No :M2011445 ；分类命名是Bacillus megaterium WH320-PHIS1525-MLS!；保藏时间是2011 年12月5日；保藏单位是中国典型培养物保藏中心；保藏地址是中国武汉武汉大学。进一步的，本发明将重组巨大芽孢杆菌菌株(WH320-PHIS1525-MIA)用加入终浓度为0. 2%木糖进行诱导，使融合基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。间接免疫荧光检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。本发明在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，使用安全无毒的巨大芽孢杆菌表达系统，巨大芽孢杆菌不产细胞内毒素，不产胞外碱性蛋白酶， 有利于所表达蛋白的稳定积累，质粒稳定，可以稳定高效地表达蛋白，比较适合工业化发酵生产。同时芽孢杆菌在肠道定植后，能消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对肠道的定植。也有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。本发明所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“重组宿主菌株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定， 否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代 (Batzer et al. ,Nucleic Acid Res. 19 :5081(1991) ；Ohtsuka et al. ,J. Biol. Chem. 260 2605-2608(1985) ；Rossolini et al.，Mol Cell. Probes8 :91-98(1994))。术语“表达”为外源基因在宿主中的转录或/和翻译。术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。艮口， 针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。


图 IPCR 产物电泳结果；1-3、MLS1PCR 产物；M、DL2000。图2表达质粒pHIS1525的酶切检测；1_2、质粒pHIS1525酶切产物；M、DL2000。图3PCR产物电泳结果；1-3 =Bgl II和SphI双酶切，得到的片段分别约为7500bp、 1920bp ；Ml :DL2000 ；M2 :DL15000。图4表达产物的SDS-PAGE和Western-blot分析；M 蛋白质分子量标准； 1 重组巨大芽孢杆菌WH320-pHIS1525诱导后的蛋白质；2_4、重组巨大芽孢杆菌 WH320-PHIS1525-MLS!诱导后的蛋白质；5 重组巨大芽孢杆菌WH320-pHIS1525_MLS诱导后的蛋白质的免疫印迹。图5表达产物的间接免疫荧光检测(X40) ；A :WH320-pHIS1525-MLS重组菌的IFA 试验结果，菌体细胞散发了强烈的黄绿色荧光；B :WH320-pHIS1525重组菌的IFA试验结果， 没有荧光，菌体呈红色。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例IMLS1基因巨大芽孢杆菌分泌表达载体的构建及鉴定1抗原表位序列MLS1的设计与合成 根据Genbank登录的PEDV全基因序列AF353511，找出编码S糖蛋白的22_505aa段序列，通过柔性的Linker ((GGGGS) 3)将PEDV的S1抗原位点基因和细胞壁锚定序列(CWAm6)连接起来，该序列命名为MLS1 (SEQ ID No. 1)。对稀有密码子苏氨酸(ACG)、组氨酸(CAC)、 精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。在MLS1的上游和下游分别引入BglII酶切位点和SphI酶切位点。将设计好的MLS1 序列进行人工合成，构建了重组质粒PMD18-MIA。pMD18-T Simple Vector 购自 TaKaRa (大连)公司，PMD18-MLS!的具体构建过程如下PCR扩增目的基因，在PCR反应管中按照表1所示加入试剂和溶液。表IMLS1的PCR反应体系
用量(yL) 合成基因模板Γο
dNTPs (2. 5mmol/L)2.0
引物Pl1.0引物 P21.0
IOXExTaq buffer5. 0
ExTaq DNA聚合酶1. 0
二馏水38. 0
总体积50.0Pl :5’ -GA AGA TCT ATGGATGTCACTAGGTGCCAGT 3’P2 :5， -ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTACA 3，混勻并离心后放置于PCR仪中，94°C预变性5min后，进行如下循环94°C，30s ； M°C，30s ;72°C，30s。30个循环后72°C延伸lOmin。PCR扩增完成后，取5 μ L产物用1 % 琼脂糖凝胶电泳观察。并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下将100 μ L PCR产物于1 %的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE-A (为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)溶液，混合均勻后于75°C加热融化。加0.5个DE-A体积的DE-B (为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)溶液，混合均勻。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加
0.5mlWl (为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)溶液，12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0. 7ml W2(为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂)溶液，12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm离心lmin。将制备管置于洁净的
1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量(20 μ L)水或洗脱液室温静置lmin，12000rpm离心 lmin洗脱DNA。取回收产物1 μ L 1 %琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果。并于_20°C 保存备用。PCR产物与克隆载体的连接及转化按pMD18-T Simple Vector 说明书将回收的 PCR 产物与 pMD18_T Simple Vector
6连接。连接体系见表2:表2连接反应体系
权利要求
1.猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因，其特征在于其多核苷酸序列为SEQID No. 1 所示。
2.由权利要求1所述融合基因编码的蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQID No. 2 所示。
3.含有权利要求1所述融合基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组宿主株。
5.按照权利要求4所述的重组宿主株，其特征在于所述的重组宿主株是重组巨大芽孢杆菌(feci/^As megaterium)菌株，其微生物保藏号是CCTCC No:M2011445。
6.权利要求1所述的猪流行性腹泻Sl蛋白抗原融合基因在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。
7.权利要求2所述的蛋白在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。
8.权利要求3所述的表达载体在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。
9.权利要求4或5所述的重组宿主株在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的用途。
10.按照权利要求6-9所述的用途，其特征在于所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。
全文摘要
本发明公开了猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用。本发明将猪流行性腹泻病毒S糖蛋白的S1抗原位点和细胞壁锚定序列连接得到SEQIDNo.1所示的抗原融合基因。本发明进一步的构建了含有该抗原融合基因的分泌表达载体，将其转化到巨大芽孢杆菌中在其细胞壁或其表面表达重组蛋白。免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与PEDV免疫血清发生反应，表明本发明所制备的重组蛋白与PEDV天然抗原一样具有相同的抗原性。诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白定位于菌体的表面。实验结果表明，本发明所制备的重组蛋白能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
文档编号A61K39/215GK102399806SQ20111042470
公开日2012年4月4日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者张金林, 胡晓芬, 马立保 申请人:武汉华扬动物药业有限责任公司