专利名称：猪链球菌病三价灭活疫苗及制备方法
技术领域：
本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型的三价灭活疫苗及制备方法与应用。本发明的疫苗主要适用于母猪，公猪及仔猪对猪链球菌病的防治。
背景技术：
近年来猪链球菌病在国内外集约化养猪场的感染率和发病率日益提高，所造成的经济损失日渐严重，已成为危害现代化养猪业的主要疫病之一。已知猪链球菌有33种血清型，其中的2型可引起猪急性败血症、脑膜脑炎、关节炎和急性死亡，也可导致生猪从业人员中的特定人群感染和死亡，是一种重要的人畜共患传染病(Wisselink等,2002)。国外自1968年荷兰首次报道人感染脑膜炎病例以来，已有300多人因感染猪链球菌而死亡。在我国，自七十年代以来，该病已在全国二十多个省市发生或流行，造成了不同程度的经济损 失。2005年6 8月，四川省资阳市、内江市等地区暴发了猪链球菌2型病，并导致204人感染，38人死亡(赵战勤等，畜牧兽医学报，2007)。近年来猪链球菌2型病在我国广泛存在并严重流行，已成为当前严重危害我国养猪业发展的一种主要疫病，而且给人类也造成了严重的危害；同时发现猪链球菌7型致病有不断上升的趋势，其发病率高、潜伏期长、造成饲料报酬率降低，给养猪业造成了巨大经济损失；而马链球菌兽疫亚种(兰氏分群中为C群链球菌)在我国猪场仍时有发生，严重危害着我国的养猪业。目前市售商品疫苗只有猪链球菌2型及猪链球菌2型+马链球菌兽疫亚种二价疫苗，但当前猪链球菌7型也较常见，现有疫苗不能对其起到预防作用，而且市售商品疫苗需多次免疫，成本较高，对猪只的应激较大。因此市场上急需发明一种新的能同时预防猪链球菌2型病，猪链球菌7型病和马链球菌兽疫亚种三种疾病灭活疫苗以解决上述问题。

发明内容
本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌三价灭活疫苗，该灭活疫苗为马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型的三价灭活疫苗，该灭活疫苗能同时有效的预防猪链球菌2型病，猪链球菌7型病和马链球菌兽疫亚种三种疾病，而且只需一针免疫，减少了猪只的应激，降低了成本，达到“一针多防”的效果，且不存在散毒的隐患。本发明的灭活
疫苗安全可靠。本发明的另一个目的是在于提供了一种猪链球菌三价灭活疫苗的制备方法。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案申请人:制备了一种猪链球菌病三价灭活疫苗，该灭活疫苗含有保藏号为CCTCCNO M2011405的马链球菌兽疫亚种XS的抗原，保藏号为CCTCC NO M2011282的猪链球菌2-LT的抗原和保藏号为CCTCC NO M2011160的猪链球菌7-YZ的抗原及佐剂；所述的抗原已灭活；所述佐剂为白油。上述三种菌株的抗原在所述的灭活疫苗中的配比比例相等(I I I)，所述的三种菌株的抗原的总体积占所述疫苗总体积的40% 45%。申请人:提供了一种猪链球菌病三价灭活疫苗的制备方法，其步骤包括如下内容a.将猪链球菌2-LT (保藏号为CCTCC NO :M2011282)、猪链球菌7-YZ (保藏号为CCTCCNO M2011160)和马链球菌兽疫亚种XS (保藏号为CCTCC NO M2011405)分别在TSB培养基上增殖培养(该培养基购自美国BD公司)，分别得到猪链球菌2-LT菌液，猪链球菌7-YZ菌液和马链球菌兽疫亚种XS菌液。b.分别向步骤a培养好的猪链球菌2-LT株菌液、猪链球菌7_YZ菌液和马链球菌兽疫亚种XS菌液，按总量(体积比)加入O. 3% O. 4%的甲醛溶液，置于37°C灭活48 72小时，期间每隔3 4小时搅拌I次，收集得到各灭活菌液。 C.将步骤b收集得到的灭活的猪链球菌2-LT菌液、猪链球菌7-YZ菌液和马链球菌兽疫亚种XS菌液按体积比I : I : I混合，得到混合灭活菌液，再将吐温-80与上述制备 的混合灭活菌液按体积比4 6 94 96，优选为4 96，制成水相。将白油(购自埃克森美孚公司)、司本-80和硬脂酸铝按体积比为94 6 I 2，优选为94 6 I的比例制成油相。将水相与油相按40% 45% 55% 60%体积比混合，优选为40% 60%。将水相缓慢加入油相均质3 5分钟后，制成均匀乳剂，即为油乳剂灭活疫苗。本发明的三价油乳剂灭活疫苗的保存条件为2 8°C。d、将步骤c得到的油乳剂灭活疫苗进行分装即为产品。上述抗原菌株的分离鉴定方法如下所述I.猪链球菌2型菌株LT株(猪链球菌2-LT)的分离、筛选和鉴定申请人:从2004年9月湖北省罗田县某猪场送检的有神经症状、急性死亡猪的心血中分离得到一株具有致病性的猪链球菌2型菌株(编号LT株)。经鉴定后将该菌株命名为猪链球菌2-LT (Streptococcus suis 2-LT),于2011年8月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO :M2011282(具体分离及鉴定方法见实施例I)。2.猪链球菌7-YZ的分离、筛选和鉴定申请人:于2005年8月从湖南省永州市某猪场送检的病料中分离得到一株猪链球菌7型菌株(编号为YZ株)，经鉴定后将该菌株命名为猪链球菌7-YZ (Streptococcus suis7-YZ)。该菌株于2011年5月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO :M2011160(具体分离及鉴定方法见实施例2)。3.马链球菌兽疫亚种XS株的分离、筛选和鉴定申请人:从浙江省萧山某猪场患病猪关节中分离得到一株马链球菌兽疫亚种(编号为XS株)，经鉴定后将该菌株命名为马链球菌兽疫亚种XS(Str印tococcus equi subsp.zooepidimicusXS)。该菌株于2011年11月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO :M2011405(具体分离及鉴定见实施例3)。上述三个抗原菌株的微生物学特征猪链球菌2型，猪链球菌7型和马链球菌兽疫亚种菌株均为链球菌属，其中猪链球菌2型和猪链球菌7型细菌大小为0. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状。马链球菌兽疫亚种菌种大小约为0. 5 1cm，陈旧培养物中菌体呈卵圆形，固体培养基中该菌以单个或短链形式存在，液体培养基中培养物形成长链，菌体表面能形成荚膜。本发明的猪链球菌三价灭活疫苗主要应用于猪场中种猪和仔猪对猪链球菌病的预防，降低猪场猪链球菌病的发病率，提高仔猪存活率。本发明的优点是可以同时预防猪链球菌2型，猪链球菌7型和马链球菌兽疫亚种引起的疾病，对于同血清型的免疫保护效果达到85%以上，相对于目前的商品疫苗来讲，可以单针免疫较多的血清型，达到“一针防多病”的目的，且使用方便，减少了猪只应激，而且不存在散毒的隐患，安全可靠。更详细的技术方案见《具体实施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO : I是扩增⑶H基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是扩增CPS2J基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 3是扩增CPS7J基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 4是扩增SodA基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 5是扩增类M蛋白基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 6是扩增Fnz基因的核苷酸序列。图I :一种猪链球菌通用引物扩增的PCR示意图。图中M DNA分子Marker ; I 4 :猪链球菌分离菌株和猪链球菌2型标准菌株；5 :猪链球菌LT分离株。图2 :—种猪链球菌2型引物扩增的PCR示意图。图中I :猪链球菌2-LT分离株；2 =DNA分子Marker3 5 :猪链球菌分离株；6 阴性对照(H20。图3 : —种猪链球菌通用引物扩增的PCR示意图。图中I 4 :挑取的待鉴定的猪链球菌；5 :猪链球菌7型标准菌株，6 :猪链球菌YZ分离株。图4:猪链球菌7型引物扩增的PCR示意图。图中I :猪链球菌7-YZ ;2 4 :挑取的待鉴定的猪链球菌5 阴性对照。图5 :马链球菌兽疫亚种乳胶凝集示意图。图中1，2和4 6分别为A，B，D，F，G群标准乳胶，3为C群标准乳胶。图6 :马链球菌兽疫亚种引物扩展的PCR示意图。图中M =DNA分子marker ;1_3 :待鉴定的马链球菌兽疫亚种菌株；4 :分离的马链球菌兽疫亚种XS株
具体实施例方式为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。实施例I :猪链球菌2-LT株的分离和鉴定。待分离的病料——各组织病料是申请人的发明人于2004年9月分离于湖北罗田某猪场有神经症状、急性死亡猪的心血中分离得到。其具体分离方法为无菌采集心血接种于TSA (购自美国BD公司)平皿上，370C培养12-24小时后观察。挑取直径为O. lmm-1. Omm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37°C摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状球菌，对其传代纯化。猪链球菌2型的分类鉴定，采用PCR方法、生化鉴定及玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下(I)PCR方法鉴定根据参考文献(赵战勤，2007年)合成猪链球菌通用引物和猪链球菌2型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号gblEF539838. Il)设计上游引物为JP4(5’ -CCATGGACAGATAAAGATGG-3’ )； 下游引物为JP5 (5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3，)，可扩增长度为 689bp 的目的 DNA片段(见SEQ ID NO: I)(其PCR图片见附图I)。猪链球菌2型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps2J (基因登录号JN024705. I)设计上游引物为 Cps2J-F (5，-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3，)，下游引物为cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可扩增长度为 557bp 目的DNA片段(见SEQ ID NO 2)(其PCR图片见附图2)。PCR模板的制备取Iml培养的菌液到无菌的1.5ml离心管中，12000r/min离心5分钟，去掉上清,用200 μ I无菌水悬浮混匀，100°C水浴中煮10分钟，然后迅速置于冰上冷却5分钟，12000r/min离心2分钟，上清即为PCR模板。PCR反应体系(总体积25 μ I)IOXTaq Buffer2. 5 μ 1,2 μ M dNTPs I. 5 μ 1，20 μ M 上、下游引物各 I μ 1，TaqDNA聚合酶I μ I，无菌水14 μ I,模板4 μ I。退火温度为94°C30 秒，58°C 60 秒，72°C 40 秒，30 循环。PCR结果观察取PCR 扩增反应产物 10 μ I 和 Mark2000plus 5 μ 1，加到含 EB 的 O. 8% (V/V)琼脂糖胶中，在80伏电压下电泳30分钟，然后在紫外线灯下观察。(2)生化鉴定从TSA平板上挑取步骤(I)中鉴定为阳性的单菌落，进行常规的生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照该公司产品说明书进行操作。结果猪链球菌2-LT株的各项生化指标均符合(见表I)。(3)玻片凝集试验将分离的猪链球菌2-LT株接种TSB培养基(购自美国BD公司)，置37°C摇床170rpm/min，培养8小时，使0D600达到I. 3 I. 5，采用玻片凝集的方法对该菌液进行血清学分型鉴定。具体操作方法如下取洁净玻片I张，用微量移液器吸取3 μ I猪链球菌(SS)标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取3μ I生理盐水做对照，然后吸取3μ I菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀(注每次加样都要更换移液器的TIP头)。轻轻摇动载玻片，I 2min后观察结果。血清与待检菌液混合后出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍为均匀混浊状态，即判定为凝集反应阳性。若血清与菌液混合后为均匀混浊状态，没有出现明显可见的凝集块判定为阴性。玻片凝集试验表明，本发明分离的猪链球菌2-LT株仅与猪链球菌2型标准阳性血清发生凝集反应，不与其他血清型凝集。表I猪链球菌2型生化鉴定试验
权利要求
1.一种猪链球菌病三价灭活疫苗，其特征在于，该灭活疫苗含有保藏号为CCTCC NO:M2011405的马链球菌兽疫亚种XS的抗原，保藏号为CCTCC NO M2011282的猪链球菌2-LT的抗原和保藏号为CCTCC NO M2011160的猪链球菌7-YZ的抗原及佐剂；所述的抗原已灭活；所述佐剂为白油。
2.如权利要求I所述的猪链球菌病三价灭活疫苗，其特征在于，所述的三种抗原的体积比为I : I : 1，所述的抗原的总体积为所述灭活疫苗总体积的40% 45%。
3.一种猪链球菌病三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤 a.将保藏号为CCTCCNO :M2011282的猪链球菌2-LT菌株，保藏号为CCTCC NO:M2011160猪链球菌7-YZ菌株和保藏号为CCTCC NO M2011405的马链球菌兽疫亚种XS菌株分别增殖培养，得到猪链球菌2-LT菌液，猪链球菌7-YZ菌液和马链球菌兽疫亚种XS菌液； b.分别向上述培养好的猪链球菌2-LT菌液，猪链球菌7-YZ菌液和马链球菌兽疫亚种XS株菌液中按菌液总体积加入O. 3% O. 4%的甲醛溶液，置于37°C灭活48 72小时，期间每隔4小时搅拌I次，即为灭活的菌液； c.将上述收集的灭活的猪链球菌2-LT菌液，猪链球菌7-YZ菌液和马链球菌兽疫亚种XS菌液按体积为I : I : I的比例混合，再将吐温-80与上述混合菌液按体积比为4 6 94 96混合，制成水相；将白油、司本-80和硬脂酸铝按体积比为94 6 I 2的比例制成油相；将所述的水相与油相按体积比为I : I. 5的比例混合，将水相缓慢加入油相均质3 5分钟后，制成均匀乳剂，即为灭活疫苗； d.将步骤c得到的灭活疫苗分装得产品。
4.一种专用于生产权利要求I所述的猪链球菌病三价灭活疫苗的菌株，其特征在于该菌株分别是猪链球菌2-LT，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO M2011282 ;猪链球菌7-YZ，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO:Μ2011160和马链球菌兽疫亚种-XS，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO Μ2011405ο
全文摘要
本发明属于动物疫苗制备技术领域，具体涉及一种马链球菌兽疫亚种、猪链球菌2型、猪链球菌7型的三价灭活疫苗及制备方法与应用。本发明的灭活疫苗主要适用于母猪，公猪及仔猪对猪链球菌病的防治。本发明公开了三株专用于制备猪链球菌病三价灭活疫苗的菌株的分离、鉴定及应用，三株疫苗菌株分别为猪链球菌2-LT株(保藏号为CCTCC NOM2011282)；猪链球菌7-YZ株(保藏号为CCTCC NOM2011160)和马链球菌兽疫亚种XS株(保藏号为CCTCC NOM2011405)。本发明的灭活疫苗能够达到“一针多防”的效果，减少猪只应激，且灭活疫苗安全可靠，不存在散毒的隐患。
文档编号A61P31/04GK102949714SQ201110376199
公开日2013年3月6日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者金梅林, 康超, 陈波, 尹珍艳, 徐高原, 陈关平, 滑亚峰, 陈章表 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司