专利名称：整合素阻断剂多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制血管生成、具有整合素亲和性和结合能力的整合素阻断剂，此阻断剂包括两种多肽，该整合素阻断剂多肽可用于实体肿瘤和类风湿性关节炎的治疗。
背景技术：
近年我国肿瘤的发病率和病死率不断增长。无限制生长、侵袭和转移是肿瘤的恶性标志和特征，也是导致治疗失败和死亡的主要原因。因此，控制肿瘤的生长、侵袭和转移 是改善预后，提高生存率的主要措施。1971年Folkman首先提出肿瘤生长依赖血管新生的理论，肿瘤血管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础，它不仅向肿瘤提供营养，也向宿主输出大量的肿瘤细胞导致肿瘤的生长和转移。绝大多数恶性实体肿瘤如卵巣癌、肝癌、宫颈癌和乳腺癌等都是血管依赖性肿瘤。新生血管一方面为肿瘤生长提供营养和氧气，另一方面还是肿瘤转移的重要途径。因此，抑制肿瘤血管形成是重要的抗癌措施。整合素是ー类广泛分布于细胞表面的受体，能介导血管内皮细胞和肿瘤细胞的黏附，它们通过连接胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用參与血管生成和肿瘤转移。目前至少有8种的整合素(al@l、a2M、a3M、a6M、a6@4、a5M、a v旦3、a V ^ 5)參与肿瘤血管生成，其中a V P 3发挥着重要作用。a v P 3由a v亚基(⑶51，150kD)和￠3亚基(⑶61，105kD)形成的跨膜异ニ聚体糖蛋白，又名VN受体。a v ￠3能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp, RGD)。a v ￠3可以表达于多种细胞类型，并与多细胞活动过程中的多种配体结合，參与肿瘤的血管生成，侵袭转移过程。含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗剂作用，能減少细胞表面黏附分子的表达，调节细胞内信号转导，抑制肿瘤血管生成从而抑制肿瘤生长和转移。因此，以整合素为靶点的整合素阻断剂能够阻断整合素的下游的胞内信号传导，可有效地抑制肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤生长和转移，在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。目前，国际上开发出的整合素阻断剂已进入II期临床，而我国尚未有相似或同类产品进入市场，非常有必要开发我国自主知识产权的此类药物。先前的专利ZL200610039298. 2血管生成抑制多肽及其制备方法和应用，主要是通过对整合素第6_49个氨基酸进行改造和修饰，修饰改造后的多肽具有比内皮抑素更好的体内活性和肿瘤靶向性。其介绍了几种整合素抑制剂，其中有两个为Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-CyS-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe (简称EDSM-1，见 Seq NO. 4)Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (简称EDSM-2，见Seq NO. 5)。这两个序列包含了整合素配体序列Arg-Gly-Asp和 Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys (见 Seq NO. 6)和新生血管抑IfjlJ 序歹I」 (Phe_Gln_Pro_Val_Leu_His_Leu_Val—Ala_Leu—Asn_Ser_Pro_Leu_Ser_Gly_Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe,见 Seq NO. 7)。先前专利中只是对多肽 EDSM-1 和EDSM-2的克隆、原核表达载体的构建和EDSM-I治疗肝癌和胃癌进行了初歩研究。本发明针对内皮抑素序列做了进ー步研究，发现整合素第6-48个氨基酸具有更好的抑制血管生成的作用，并对其进行了修饰，修饰后的多肽是在血管生成抑制序列Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Aia-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Giy-Met—Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala(见Seq NO. I)的N端/C端加上了整合素配体序列(Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly)构建了两种整合素阻断剂即多妝 II (Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-CyS-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala (见 SeqNO. 2))和多妝 III (Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser- Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp(见 Seq NO. 3)),其中整合素配体序列中含有RGD序列(Arg-Gly-Asp)，使该多肽序列可以有效地结合于肿瘤特异性表达的整合素亚型，并且该序列中含有新生血管抑制序列，能够抑制肿瘤新生血管形成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。新设计的多肽序列多肽II和多肽III是具有靶向结合作用和亲和性的整合素阻断剂，并发现其对多种肿瘤有治疗作用，増加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床最常见的炎性关节病和主要致残因素之一。在全世界约为0.5%-1.0%,RA的发病在我国约为0.4%。RA可发生于任何年龄，随着年龄的增长，发病率也随之增高。女性高发年龄为45-55岁，性别与RA发病关系密切，男女之比约I : 3。RA是ー种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病，以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，属于自身免疫炎性疾病。患者常以手部或腕部疼痛及肿胀(特别是腕背部的肿胀)为首发症状，症状持续不缓解，普通的对症治疗虽可以缓解症状，但常常由于用药不规则或不足量而导致症状反复。病情进展时可以出现明显的晨僵，通常可达I小时以上，并不断加重；同时出现一定的关节功能障碍。类风湿关节炎的病因和发病机制尚未完全明了，其基本病理特点是血管炎和滑膜炎。关节内滑膜血管增生，形成血管翳，导致滑膜增厚，渗出增多，分泌多种细胞因子，侵犯软骨并引起骨质损害。对其周围的肌腔、韧带、腱鞘以及肌肉等组织也均可侵蚀，从而影响关节的稳定，容易发生关节畸形而出现功能障碍。血管炎亦可侵犯周身各脏器组织，形成系统性疾病。目前治疗RA的药物分为两大类控制症状药和控制疾病药。控制症状的抗风湿药分为四类一、非留体类抗炎药，通常称为ー线药，这类药物种类繁多，国内市场已多达数十种。ニ、类固醇激素，激素是ー个非常好的止痛抗炎药，但长期単独使用不能改善病情，反而带来许多副作用，激素作为ニ线慢作用药起效前的过渡性用是可以的，但用量要小，时间不宜过长。在病情较重，伴有关节外表现的患者，短期治疗冲击，并联合ニ线药治疗时必须的。三、慢作用抗风湿药，通常称为ニ线药，所谓慢作用药包括抗疟药、金盐、青霉胺和柳氮碘胺吡啶，它们治疗RA起效慢，长期作用对RA病情有一定缓解作用，故也称病情改善药。四、免疫抑制剂常用有甲氨喋呤、环磷酰胺、硫唑嘌呤、雷公藤、青风藤等。RA的病理过程中，血管新生是ー种标志性的组织学改变，新生血管形成伴随滑膜增生和炎细胞浸润，是RA中血管翳形成及关节破坏的基础。原来应该没有血管存在的关节软骨因某种异常变化，而形成新的血管，使得软骨受到侵蚀，造成关节变形或疼痛。新生血管引起类风湿关节炎患者滑膜组织发生异常变化，正常人的关节滑膜内层仅1-2层细胞组成，而RA患者的滑膜 内层通常有4-10层细胞(有时甚至超过20层)。这些细胞不仅在数量上异常增多，而且在功能上处于异常活跃的状态，它们可以分泌大量的细胞因子、信号分子和蛋白酶，加速关节破坏的进程。另外，RA滑膜中还有大量炎性细胞的浸润，如T细胞、B细胞和单核细胞。新生血管生成，在正常生理条件下，受到高度调节，在生殖、胚胎发育、组织修复和创伤愈合中是必不可少的过程。血管生成在多种病理条件下也会发生，所述病理条件包括肿瘤生长和转移；炎性障碍，例如类风湿性关节炎、银屑病、骨关节炎、炎性肠病、克隆病、溃疡性结肠类以及其它炎性障碍。整合素是a V 0 3能识别配体分子中的精-甘-天冬序列(arg-gly-asp, RGD)并与多细胞活动过程中的多种配体结合參与肿瘤的血管生成、侵袭、转移、炎症、伤ロ愈合和凝血等生理和病理过程。因此，含有RGD序列的多肽具有整合素拮抗剂作用，RGD序列可以作为ー种载体，靶向运输到新生血管内皮，从而对新生血管性疾病达到更高效率的治疗。因此，血管抑制多肽通过抑制血管生成不仅可阻止向滑膜输送氧气和营养物质，且直接导致血管退化，从而可能抑制RA滑膜增生。抑制新生血管的形成是治疗这类疾病的关键，而内皮细胞的増殖和迁移是新生血管形成的关键步骤。多肽II和多肽III含有RGD序列(Arg-Gly-Asp)，使该多肽序列可以有效地结合于整合素，并通过抑制胞内细胞骨架蛋白和细胞外基质分子的相互作用，抑制细胞与细胞外基质及细胞与细胞之间的相互黏附，来抑制细胞与细胞外介质及细胞与细胞间的信号传导，从而抑制血管生成。此外该序列中还含有新生血管抑制序列，研究发现其具有高效抑制新生血管生成的活性，特别是对类风湿性关节炎类疾病有很好的作用。血管抑制多肽针对抑制血管新生治疗类风湿关节炎的作用靶点，为开发新型类风湿关节炎药物提供新的研究方向。新设计的多肽序列多肽II和多肽III是对整合素具有靶向结合作用和亲和性的多肽，前期研究发现多肽II和多肽III能够抑制内皮细胞的増殖、迁移、小管生成，并用流式细胞仪分析了多肽II和多肽III的作用靶点为整合素a V 03。后研究发现其还能抑制大鼠动脉环的管状结构形成，并通过细胞粘附实验验证了多肽II和多肽III的作用靶点为整合素a V ￠3，并发现其对类风湿性关节炎有治疗作用，増加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。

发明内容
发明目的本发明针对多肽I、多肽II和多肽III做了进ー步研究，发现其对多种实体肿瘤和类风湿性关节炎有治疗作用，増加了其适应症。
技术方案整合素阻断剂多肽，其特征在于其氨基酸序列为X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-GIy-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Y, X 的序列为缺失、Arg-Gly-Asp^Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly^ Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 或 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CyS-Gly-Gly-Gly-Gly ；Y 的序列为缺失、Arg-Gly-Asp^Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly^ Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 或 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Glyo所述的整合素阻断剂多肽，其特征在于所述的氨基酸序列为多妝I :Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多妝II Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-AIa-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-CyS-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多妝III Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ；多妝IV Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CyS-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu~Val-A_La-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-G_Ly-Met-Arg-Gly-I Ie-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-CyS-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多妝V Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-CyS-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-GIn-Pro~Val-Leu-His-Leu~Val—Ala_Leu—Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-G _Ly-Gly—Met—Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多妝VI Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-GIy-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-VaI-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ；多妝VII Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp ；多妝VIII Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ；
多妝IX Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-GIy-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-VaI-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ；
多妝X Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-PrO-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala及其含有有效量上述多肽可接受的盐，或必要时药学上可接受的载体或者赋形剂。根据权利要求1、2任意一项所述的整合素阻断剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巣、子宫颈、子宮、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。根据权利要求1、2任意一项所述的整合素阻断剂多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
根据权利要求1、2任意一项所述的整合素阻断剂的制备方法，其特征在于所述的多肽是通过固相合成方法或通过重组表达体的方法制备而得。根据权利要求根据权利要求1、2任意一项所述的整合素阻断剂，其特征在于所述的多肽共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚こニ醇。根据权利要求4整合素阻断剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的药物组合物可通过多种给药方式治疗原发或继发的癌、黑色素瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，ロ服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。有益效果I、先前专利ZL200610039298. 2报道了内皮抑素第6_49个氨基酸具有较好的抗肿瘤作用，本发明对此做了大量研究，发现内皮抑素第6-48个氨基酸(多肽I，命名为EDSM，见SeqNO. I)具有更好的抗肿瘤作用，同时还发现多肽I能有效治疗类风湿性关节炎，增强了适应性，増加了适用症，同时减少一个氨基酸，合成成本更低，拓展了其社会价值和经济价值。多肽II和多肽III是本实验室设计合成的新的氨基酸序列，尚未在国内外申请发明专利授权，先前专利ZL200610039298. 2所报道的EDSM-I和EDSM-2氨基酸数目分别是47和55，相比之前的序列，多肽II和多肽III在整合素配体序列RGD和新生血管抑制序列之间加入了 4个Gly，在EDSM-I的基础上增加了柔性，使得整合素配体序列R⑶更易与靶点结合，活性更高；在EDSM-2的基础上减少了氨基酸数目，但依然保持了较高的抗肿瘤活性，大大降低了成本；同时还发现多肽II和多肽III具有较好的治疗类风湿性关节炎的作用，增强了适应性，増加了适用症，拓展了其社会价值和经济价值。2、药理作用机理介绍研究发现，多肽I具有抑制肿瘤血管生成和治疗类风湿性关节炎的作用。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是整合素的ー个重要配体，因此，含有RGD序列的多肽Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp也能够特异性的识别整合素。本发明的整合素阻断剂多肽是在具有抑制血管生成作用的序Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-GIy-GIy-Met-Arg-GIy-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-CyS-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala 的 N/C 端连接上与整合素家族具有亲和性和結合能力的含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)的Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp序列，构建了与整合素有亲和性和結合能力的多肽II和多妝 III。该整合素阻断剂多妝 II (Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu~Vai—Ala-Leu—Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly—Met—Arg-Gly-IIe—Arg—Gly—Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala)和多妝 III(Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-AIa-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp),为含有 50 个氛基酸的多肽，分子中RGD序列具有整合素亲和性和结合能力，研究表明其作用靶点主要为整合素a V ￠3，具有整合素拮抗剂作用，能減少细胞表面黏附分子的表达，调节细胞内信号转导。并且该序列中含有新生血管抑制序列，从而抑制肿瘤新生血管形成，进而达到抑制肿瘤生长和转移的效果。国内外大量的研究表明即使是同一组织类型、分化程度相同的肿瘤，对同一药物的敏感性也有可能不同，因此，药物开发中对某一分子需要进行抗肿瘤谱的筛选。因为有些药物只对特定肿瘤细胞有效，对其他肿瘤是无效或低效，因此需要实验去摸索和验证其治疗效果。发明人经过大量实验获知该整合素阻断剂靶点明确，在体外能够明显抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移、增殖及管状结构的形成，对人的某些肿瘤细胞的增殖也有抑制作用。体内实验具有明显的抗肿瘤效果，且副作用小、用量少、成本低。说明本发明设计的整合素阻断剂多肽科学、合理、可行有效，能作为制备治疗人类实体肿瘤的治疗药物，极大拓展了该整合素阻断剂的治疗谱，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。本发明的多肽II和多肽III含有由于具有靶向性的RGD序列，多肽可以靶向到RA中血管翳形成过程中新生血管内皮，抑制新生血管形成，进而达到预防或治疗类风湿性关节炎的效果。发明人经过大量实验获知多肽II、多肽III能够抑制佐剂型大鼠类风湿关节炎和DBA/1小鼠胶原型类风湿性关节炎的发展，体内实验证明具有显著的治疗类风湿型关节炎的效果，并且副作用少，用量少成本降低。说明本发明设计的多肽科学、合理、可行有效，能作为治疗或预防类风湿性关节炎药物，极大拓展了该多肽的疾病治疗范围，为将来药物开发提供了新的思路和前景，具有显著的社会价值和市场价值。


附图I Western blotting 检测 integrin a v 和 integrin P 3 在 Bel-7402 细胞中的表达；附图2流式细胞实验检测整合素阻断剂多肽II与靶点的结合；附图3流式细胞实验检测整合素阻断剂多肽III与靶点的结合；
具体实施例方式实施例I整合素阻断剂多肽合成肽的制备及检验多肽I、II、III均采用固相合成法合成，采用高效液相色谱法纯化，并采用MS測定多肽的分子量，RP-HPLC測定多肽的纯度。多妝多妝I 固相合成法是以 Fmoc-Phe (Otbu)-wang resin 或Fmoc-Arg (Otbu)-CTCresin为起始原料，多肽II固相合成法是以Fmoc_Arg(Otbu)-wang resin或Fmoc-Arg (Otbu) -CTC resin 为起始原料，多妝 III 固相合成法是以 Fmoc-Phe (Otbu)-wangresin或Fmoc-Phe(Otbu)-CTC resin为起始原料,然后用保护氨基酸依次接ニ肽至四十三/五十肽，接肽工作完成后充分洗涤，然后切肽、后处理即得整合素阻断剂多肽11/多肽III粗品。将粗品溶解，用制备型高效液相经过两次纯化，最后浓缩冻干得到纯品。该方法不仅保证了合成的效率，又提高了纯度。I.接肽(包括接ニ肽至四十三/五十肽)的步骤如下多妝I :称取 Fmoc-Phe (Otbu)-wang resin 或 Fmoc-Arg (Otbu)-CTC resin 适量，倒入玻璃砂芯反应柱中，加入CH2Cl2适量使树脂充分膨胀。
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多妝II :称取 Fmoc-Arg (Otbu)-wang resin 或 Fmoc-Arg (Otbu)-CTC resin 适量，倒入玻璃砂芯反应柱中，加入CH2Cl2适量使树脂充分膨胀。多妝III :称取Fmoc-Phe (Otbu)-wang resin或Fmoc-Phe (Otbu)-CTC resin适量，倒入玻璃砂芯反应柱中，加入CH2Cl2适量使树脂充分膨胀。a、脱帽加入六氢吡啶/DMF的脱帽液适量，反应一段时间后将脱帽液抽干，中间用DMF洗涤一次，然后再加入一次脱帽液适量反应，脱去Fmoc保护基。b、洗涤将脱帽液抽干，用DMF洗涤树脂几次，充分洗净副产物。C、缩合将用于接肽的保护氨基酸和激活剂溶于DMF和缩合剂中，摇勻，并充分反应。d、洗涤将反应液抽干，用DMF充分洗涤树脂，洗净副产物。所述切肽的步骤如下把抽干的树脂装入圆底烧瓶中，加入切割液充分裂解合好的五十肽中间体，用砂芯漏斗将树脂与多肽分离，所述的裂解液的体积组成为三氟こ酸苯酚水苯甲硫BI: EDT = 88-92 2. 5-3. 5 2. 5-3. 5 I. 5-2. 5 I. 5-2. 5。2.后处理步骤如下先加无水こ醚到切割液中将多肽析出，然后离心，把清液倒掉，然后再用无水こ醚洗涤多肽，抽干得多肽粗品。3.纯化的步骤如下a、溶解称取粗品配制成5_20g/l的溶液，用0. 45 y m的混合滤膜过滤。制备①一次纯化用30% -40%的こ腈和60% -70%的缓冲溶液，流速为50ml/min-100ml/min下冲洗10min-20min平衡制备柱。用输液泵上样,采集基线，收集紫外波长220nm吸收值大于200mv的溶液，检验是否有样品。用梯度洗脱，こ腈的起始百分数为30% -40%，30-50min后こ腈的百分数为80% -90%。收集紫外波长220nm吸收值大于200mv的溶液，检测纯度大于95%的合并作为峰顶，待做二次分离纯化。②二次纯化将ー次收到的峰顶旋转蒸发掉有机溶剂后用输液泵上样，用30% -40%的こ腈和60% -70%的缓冲溶液。流速50-100ml/min，并采集基线，收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，检测是否有样品冲出。用梯度洗脱，こ腈的起始百分数为30% -40%，30-50min后こ腈的百分数为80% -90%。收取在紫外波长220nm吸收大于200mv的溶液，通过检测纯度大于95%的作为合格。b、浓缩、过滤、冻干将合格溶液用旋转蒸发仪37°C减压浓縮，除去残留溶剂和注射用水。最后用0. 22 ii m滤膜过滤,滤液装入冻干盘中,用冷冻干燥机进行冷冻干燥。
4.纯度检测及分子量检测收集冻干后的纯化产物，通过反向液相检测多肽纯度分析純度。本实验成功采用固相合成法合成了整合素阻断剂多肽I、多肽II和多肽III，此方法重复性高，可操作性強，污染少；实验可采用两种树脂来合成多肽即wang resin或CTCresin ;实验用wang resin,相对其它树脂比较稳定,副反应少,エ艺粗品峰型较好,纯化相对收率高，所以成本相对较低；实验用CTC resin反应受温度影响小，反应速率快；并使用反相高效液相法纯化多肽，使用梯度洗脱相对于等度洗脱来说，分离效果更好，分离过程中，保留时间合适，生产效率高，纯度高。结果合成的多肽经反向液相色谱分析进行纯度鉴定结果如下多肽I、多肽II、多肽III纯度分别为95. 39%,98. 41%,96. 40%纯度均大于95%，符合设计要求。实施例2 整合素阻断剂多肽II和多肽III靶点分析。(I)Western Blotting 分析细胞表达的祀点 integrin a v ￠3用0. 25%胰蛋白酶消化对数生长期细胞Bel-7402，800rpm离心5min收集细胞；计数，按20 iil/1 X IO5个细胞加入蛋白质提取液，吹吸打散细胞，4°C放置30min使细胞裂解；加入1/4体积5X蛋白质上样缓冲液，沸水浴5-10min。取20ii I蛋白质样品，进行10%SDS-PAGE电泳；半干式电转移法将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上，恒流lmA/cm2，3h ;将PVDF膜在丽春红中染色30s，dH20脱色至有清晰条带，将右上角剪去以区分蛋白面；将PVDF膜用封闭液室温封闭I. 5h ；PBST洗膜2-3次，每次5-10min。加入ー抗，4°C过夜或37°C孵育I. 5h ；PBST洗膜3-5次，每次5-10min。加入ニ抗，室温孵育Ih ；PBST洗膜3_5次，每次5-10min。在暗室(允许红色光源)中，将PVDF膜蛋白面朝上放在保鲜膜上，向表面均匀滴加发光液，反应5min ;将PVDF膜包裹在保鲜膜中，剪下一块等大的X光胶片，放置夹片盒曝光0.5-5min(视条带光强度而定)；取出X光胶片，在显影剂中漂至条带出现，放到停影液(5%冰醋酸)中停影lmin，用流水冲洗Imin后在定影剂中漂至背景部分透明，最后流水冲洗20min固定影像。(2)流式细胞实验分析整合素阻断剂多肽II和多肽III与靶点的结合细胞Bel-7402在细胞瓶中培养至80%的融合后，消化收集，用冰预冷的PBS洗2次，将细胞用含1% BSA的PBS重悬30min ;用2yl鼠抗人a v @ 3功能阻断单克隆抗体(I. Oiig/iil，I 200)和2iil 鼠抗人 a 53 I 功能阻断单克隆抗体(I. Oiig/iil，I 200)与细胞悬液在4°C孵育I. 5h ;将细胞收集，并用冰预冷的PBS洗涤2次，之后用100 ill FITC标记的修饰多肽II和多肽III (2mg/ml)与细胞悬液在4°C孵育I. 5h ;标记后将细胞收集并用冰预冷的PBS洗涤2次，之后400 u I PBS重悬，用流式细胞仪分析，FITC荧光用FLl通道检测荧光強度。结果细胞表达的靶点integrin a v ￠3的測定，如图I所示，Bel-7402细胞表面表达integrin a v 0 3，可以作为后期靶点结合试验的对象。流式细胞试验分析整合素阻断剂多肽II和多肽III与靶点的结合，结果如图2、3所示FITC标记的整合素阻断剂多肽II在细胞不加入抗体孵育是荧光強度大约是80. 4%,加入integrin a v 0 3抗体之后突光强度减弱至13. 4%,加入integrin a 5 0 I抗体之后荧光强度减弱至33. 2% ;FITC标记的整合素阻断剂多肽III在细胞不加入抗体孵育是荧光强度大约是82.4%，加入a V ￠3抗体之后荧光强度减弱至11.3%，加入integrina 5 @ I抗体之后荧光强度减弱至25. 9%。经流式细胞仪检测分析发现，多肽II和多肽III能够同时和integrin a v 0 3和integrin a 5 @ I结合,但主要的结合祀点仍为integrina V 旦 3。实施例3整合素阻断剂多肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移抑制试验将10mg/ml Matrigel (BD公司，USA)用HUVEC专用培养基以I : 2稀释，涂布于transwell小室膜上，室温风干。将培养到对数生长期的HUVEC细胞用胰蛋白酶消化液消化，收集，用PBS洗涤两次后用空白HUVECs专用培养基重悬。在显微镜下计数，将细胞浓度调整到I X IO5个/ml。配制各组的试验用液，用空白HUVECs专用培养基稀释到100 yl。将细胞接种到transwell小室中，每孔IOOy 1，并且将各组试验用液加入小室中。24孔板中加入0. 6ml含5%胎牛血清和1% ECGS的内皮细胞培养液刺激细胞迁移，于5% CO2, 37°C 培养24h。弃去孔中培液，用90%酒精常温固定30min，0. I %结晶紫常温染色lOmin，清水漂净，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，显微镜下观察并选择四个视野拍照计数。按照公式计算迁移抑制率(migration inhibition, MI)
NtestMI (%) = I - - X100%
^control其中Nt6st为测试组的细胞迁移数，Ncontrol为空白对照组的细胞迁移数。试验独立重复3次，试验得到的结果计算mean土 SD，并进行统计t检验，*P < 0. 05为显著性差异，**P < 0. 01为极显著性差异。表I整合素阻断剂多肽I对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移抑制作用
权利要求
1.整合素阻断剂多肽，其特征在于其氨基酸序列为X-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Y, X的序列为缺失或含有Arg-Gly-Asp序列的多肽，Y的序列为缺失或含有Arg-Gly-Asp序列的多肽。
2.根据权利要求I所述的整合素阻断剂多肽，其特征在于所述的氨基酸序列中X的序列包括Arg_Gly_Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly ；Y 的序列包括Arg_Gly_Asp、Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly、Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys 或 Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Glyο
3.根据权利要求I所述的整合素阻断剂多肽，其特征在于所述的氨基酸序列为多月太 I Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多妝 II Arg-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多月太 III Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-GIy-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ；多月太 IV Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-CyS-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多妝 V Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-IIe-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala ；多月太 VI Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-GIy-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Arg-Gly-Asp ；多月太 VII Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-GIy-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Arg-Gly-Asp ；多月太 VIII Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Gly-Gly-Gly-Gly-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ；多月太 IX Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-Leu-Ser-Gly-GIy-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Ala-Cys-Asp-Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys ；多月太 X Arg-Gly-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Ser-Pro-LeU-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala-Val-Gly-Leu-Ala-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala及其含有有效量上述多肽可接受的盐，或必要时药学上可接受的载体或者赋形剂。
4.根据权利要求1、2、3任意一项所述的整合素阻断剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巣、子宫颈、子宮、前列腺、膀胱或睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。
5.根据权利要求根据权利要求1、2、3任意一项所述的整合素阻断剂，其特征在于所述的多肽共价连接佐剂，佐剂是牛血清白蛋白、人血清白蛋白或聚こニ醇。
6.根据权利要求1、2、3任意一项所述的整合素阻断剂多肽在制备治疗或预防类风湿性关节炎药物中的应用。
7.根据权利要求5整合素阻断剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的药物组合物可通过多种给药方式治疗原发或继发的癌、黑色素瘤及肉瘤，包括皮下或肌肉注射，静脉注射或者静脉滴注，ロ服给药如药丸、胶囊等，鼻喷剂。
8.根据权利要求1、2、3任意一项所述的整合素阻断剂的制备方法，其特征在于所述的多肽是通过合成方法或通过重组表达体的方法制备而得。
全文摘要
本发明涉及药物领域，具体涉及具有抑制肿瘤血管生成、具有整合素亲和性和结合能力的一类整合素阻断剂，可用于实体肿瘤和类风湿性关节炎的预防和治疗。所述的多肽具体是指多肽I、多肽II和多肽III(见Seq NO.1、Seq NO.2、Seq NO.3)；该多肽可用于治疗实体肿瘤和类风湿性关节炎。该三种整合素阻断剂多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为起源于人的头颈部、脑部、甲状腺、食管、胰腺、肺脏、肝脏、胃、乳腺、肾脏、胆囊、结肠或直肠、卵巢、子宫颈、子宫、前列腺、膀胱、睾丸的原发或继发的癌、黑色素瘤以及肉瘤。
文档编号A61K38/16GK102850443SQ20111044305
公开日2013年1月2日 申请日期2011年12月27日 优先权日2011年12月27日
发明者徐寒梅, 浦春艳, 康志安 申请人:中国药科大学