专利名称：一种黄斑蓝子鱼l-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基 因全序列及其用途
背景技术：
随着海水渔业集约化养殖程度逐渐提高，养殖密度增大，养殖环境逐渐恶化，导致 病害日益严重。抗生素和违禁药品的大量使用，这给食品安全造成严重威胁，因此开发新型 药物迫在眉睫。黄斑蓝子鱼(Siganus oramin)属于鲈形目(Perciformes)、刺尾鱼亚目 (Acanthuroidei)、蓝子鱼科(Siganidae)、蓝子鱼属(Siganus)，是近海暖水性小型鱼类。 它适宜生长的水温和盐度较广，在我国东南沿海数量较多。本发明从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化得到一种对多种病原具有抗性和杀灭作用 的活性蛋白。通过对该活性蛋白N端测序，质谱测序分析，设计兼并引物进行PCR，利用RACE 技术最终获得了该活性蛋白基因的全长序列，并确认该活性蛋白是一种黄斑蓝子鱼L-氨
基酸氧化酶。L-氨基酸氧化酶(LAAO)是一种以FAD为辅基的黄素蛋白酶，在有氧条件下，其能 催化L-氨基酸的氧化脱氨反应，产生相应的α-酮酸、氨和H202。LAAO在生物体内有广泛 的分布(如细菌、真菌、藻类、动植物体内)并可参与L-氨基酸的代谢过程。该酶在细胞凋 亡、细胞毒性、浮肿、溶血、出血、血小板凝集、杀寄生虫和抗微生物等方面都具有活性。该 蛋白家族中的蛇毒L-氨基酸氧化酶(SV-LAAO)在蝰科、响尾蛇科及眼镜蛇科中具有广泛分 布，并因其含量高、酶活性强、易于纯化，成为该类酶中研究最多的一类。

发明内容
本发明提供一种新的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因全序列(见实施例一)和 该L-氨基酸氧化酶的用途(见实施例二)。本发明提供上述黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因序列全长，该基因全序列长度 为172^p，开放阅读框长度为1584bp，其具体位置在43-16 区域，编码527个氨基酸(见 实施例一)。本发明从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化得到该L-氨基酸氧化酶，通过试验证明，该 纯化的L-氨基酸氧化酶对刺激隐核虫具有杀灭作用，对代表性革兰氏阳性菌(金黄色葡萄 球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有杀菌作用(见实施例二)。本发明还提供上述的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因序列的克隆方法，其特征 在于获得该黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶ORF的核苷酸序列，所设计的特异性引物序列见实 施例三。下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例方式实施例一黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因全序列本发明人从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化得到该活性蛋白，测定该活性蛋白N端15 个氨基酸的序列，同时进行了质谱测序分析，根据N端和质谱测序结果设计兼并引物，获得 该活性蛋白基因的部分序列，根据获得的该活性蛋白的部分序列，利用RACE技术，获得了 该活性蛋白基因全长序列，通过Blast分析确认该活性蛋白为L-氨基酸氧化酶。黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因序列全长为172^p，开放阅读框(ORF)长度为 1584bp，其具体位置在43-1626区域，编码527个氨基酸的蛋白，结果见图1。实施例二 黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的杀虫和杀菌功能验证以及最小作用浓 度测定本发明人采用硫酸铵沉淀，阳离子交换层析，反相高效液相色谱，二次反相高效液 相色谱，得到了黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶，该纯化的L-氨基酸氧化酶对刺激隐核虫具有 杀灭作用，对代表性革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有 杀菌作用，本发明人对纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶进行了杀虫和杀菌最小蛋白浓 度测定。1.黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶杀虫功能验证以及杀虫最小蛋白浓度的测定将纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶对刺激隐核虫的杀灭作用，进行了激光共 聚焦显微镜观察，结果见图2。参照Bradford protein Quantitation Reagent (上海博彩生物科技有限公司， K4000)试剂盒的操作说明进行。分光光度计测量OD595值，绘制标准曲线并推导方程，计算 目的蛋白的浓度。采用阻动试验的方法，在96孔组织培养板中，每孔先加入100 μ L灭菌海 水，然后于第一孔加入100 μ L纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶蛋白样品，混勻，再从中 吸取100 μ L加入第2孔，混勻后再从中吸取100 μ L加入第3孔，依此类推，以连续2倍数 稀释纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶蛋白样品。最后每孔同时加入IOOyL幼虫液(含 200个活跃的幼虫)，室温孵育Ih后，用倒置显微镜(Olympus 1X70)观察，结果表明，纯化 蛋白对于刺激隐核虫的最小杀虫浓度为0. 088mg/mL。2.黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶杀菌功能验证以及杀菌最小蛋白浓度测定利用生物自显影方法对所纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶对代表性革兰氏阳 性菌和革兰氏阴性菌的作用效果进行验证。将所纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶蛋白 样品进行非变性蛋白凝胶电泳，将电泳结束后的凝胶放入含有TritonX-100(V/V)的 PBS溶液中温和摇动20min，弃去TritonX-100 (v/v) PBS溶液，水洗2次，以0. lmol/LpH7. 2 磷酸缓冲液平衡30min，弃去缓冲液。取LB固体培养基加热融化，冷却至45°C左右，加入新 培养至指数期的指示菌Escherichiacoli或Maphylococcus aureus (终浓度约IO6CFU/ mL)，摇勻后平铺于一次性无菌培养皿中，待培养基完全凝固后将蛋白凝胶平铺于培养基表 面，除去中间的气泡，置37°C培养过夜，观察抑菌结果，直接拍照，结果见图3。采用梯度稀释的方法测定纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶对金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌的最小杀菌浓度。实验于96孔培养板内进行，将纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基 酸氧化酶蛋白样品溶于无菌生理盐水，并作梯度二倍稀释。将培养至对数生长期的两种细 菌分别取50 μ L加入到每个稀释孔内使其终浓度分别为2. 5Χ 105CFU/mL和7. 8 X IO5CFU/mL，以单纯培养基作为空白对照，空白培养基中加入PBS作为阴性对照。37°C培养过夜， microtiter plate reader (ThermoLabsystems MuLtisKan MK3,Finland)测定 OD 值，同时 将每个孔中取出IOyL点种于空白培养基上，37°C倒置培养过夜，没有长出菌落的对应样 品的终浓度即为该样品对该菌的最低杀菌浓度。结果表明，利用纯化黄斑蓝子鱼L-氨基 酸氧化酶测定其对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小杀菌浓度分别为5. 493 μ g/mL和 0. 352mg/mL。实施例三编码黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因序列的高保真克隆本发明人设计了一对特异性引物，在经过优化的高保真酶PCR反应体系中，以黄 斑蓝子鱼脾脏总cDNA为模板，可快速准确克隆出编码黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因 序列，用于后续基因工程。1.用于扩增编码黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因序列的特异性引物Sense Primer 5' -GGCTGAAGAAGGCAAAGAAGAAC-3‘Anti-sense Primer 5' -AACAACATTGTGCTGACAGTGGC-3‘2.高保真酶 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 反应体系5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ LdNTP Mixture (2. 5mM)4 μ LSense Primer1 μ LAnti-sense PrimerIyL脾脏总cDNA1 μ LPrimeSTAR HS DNA Polymerase0. 5 μ LH2O32. 5 μ L总计50 μ L反应条件为98°Cfor Imin ；30 cycles of 98°C for 10s，68°C forl5s and 72°C for 3min。结果见图4琼脂糖凝胶电泳图谱，将PCR产物回收与纯化，放入_80°C冰箱 保存，用于后续基因工程。


图1.杀灭刺激隐核虫的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因和蛋白序列。(注 方框内的氨基酸序列与N端测序序列和质谱测序序列匹配，横线区域为信号肽序列)图2.纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶作用于刺激隐核虫幼虫的激光共聚焦显 微镜观察。(A)未处理的正常虫体。(B)黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶与刺激隐核虫幼虫 作用后显示该蛋白主要分布在虫体的细胞膜和细胞核膜上。(C)刺激隐核虫幼虫经黄斑蓝 子鱼L-氨基酸氧化酶处理后导致虫体大核破裂，核内容物释放并弥散分布，最终导致细胞 崩解。(Scale bar = 30 μ m)图3.纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶蛋白样品的生物自显影结果。(A)纯 化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶蛋白样品经非变性凝胶电泳后的考马斯亮蓝染色结果。 (B)纯化的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶对大肠杆菌的抑菌效果。(C)纯化的黄斑蓝子鱼 L-氨基酸氧化酶对金黄色葡萄球菌的抑菌效果。图4.采用I^rimeSTAR HS DNA Polymerase扩增PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
权利要求
1. 一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因全序列GACTGTAAACAGCAGGCTGAAGAAGGCAAAGAAGAACCTGGGATGGATCT50GCACCGGGCACCGTGGAAATCATCTGCCGCCGCCGCCGTGCTGCTGCTTG100CTCTGTTCTCCGGTGCGGCAGCTTCCAGCGTGGAGAAAAATCTGGCCGCC150TGTCTGCGGGACAACGACTACGACCAGCTGCTGCAGACGGTGCAGGACGG200CCTCCCACACATCAACACATCCAACCACGTCGTGATCGTCGGAGCCGGCG250TGGCCGGACTGACGGCCGCCAAGCTGCTGCAAGACGCCGGGCACAGGGTC300ACCATAGTGGAGGCCAACAGTCGCATCGGTGGACGGGTGGAGACCTACAG350GAACAAAGAGGAAGGCTGGTACGCTGACCTGGGCGCCATGAGAATCCCAA400GTGACCACAGCATCTTCCGCTGGTTCGCTAAAACACTGGGCGTCAAGCTC450AACCCGTTCATCATGGACGACCACAACACGTTTTACTTTGTGAACGGGCT500GCTGAAAAGAACGTACACGGTGGAAGCCAACCCTGACATACTGAACTACA550AGGTGAGGAGCAGCGAGAAGGGAAAGTCGGCCAACACCCTCTTCCAGGAC600GCTCTGCAGAAGGTAAAAGATGAAGTGGAAGCTCACGGCTGCAGAGCTGC650GCTGATGAAATATGACAAATACTCTGCAAAGGAGTACCTGAAGGAAGTAG700CAGGTCTGAGCTCCGAGGCCCTGAGAATGATCGGAGACCTGCTCAACGAA750CAGAGTCTGATGTACACAGCGCTGAGTGAGATGATCTACGACCAGGCCGA800CGTCAACGACAACGTCCAGTACGATGAAGTGACCGGAGGAACCGACCTGT850TCCCCAGAGCATTCCTCTCCGTCCTCGACGTCCCCATTCTTCTCAACTCC900AAAGTCCAGCGCATCCGTCGCTCTAGAGACGGGGTGACCGTGTCGTTCAA950GGAGAGCCAGCGCTCCTCTCTGACGGACCTCCACGCTGACATGGTCCTGG1000TCACAACCACAGCCAAAGCAGCCCTCTACATGGACTTTGAGCCCAGTCTC1050TCGATCAGAAAGATGGAGGCCCTGAGGGCGGTCCACTACGACAGCTCCAC1100CAAAATCATCCTCACTTTCAGCAGCAGATTCTGGGAGGAGGACGGGATCC1150GAGGAGGAAAGAGCATCACGGACCGGCCCTCGCGTTACATCTACTACCCC1200AGCCACACGTTCCCCGCCAACTCCAGCGTCGGCGTCCTCCTGGCGTCCTA1250CACCTGGTCCGACGACTCCCTGCTCCTCCAGGCCGCCAGCGACGAGGAGC1300TGAAGGAGATGGCTCTGAGGGATCTGGTGAAGATCCATGGCGAGCGTGTC1350CGGGCGCTGTGCACTGGAGTGGTGGTGAAGAAGTGGAGCCTGGATCCCTA1400CAGCTTCGGCGCCTTCGCCCTCTTCACGCCGTACCAGCACCTGGAGTACG1450CCAAGGAGCTCTTCAGGAGCGAGGGCCGGGTTCACTTCGCCGGCGAACAC1500ACGGCGTTCCCTCACGCTTGGATGGAGTCGGCCATGAAGTCTGCAATCAG1550AGCCGCCACCAACATCAACAAACAGACGCTGCTCAACGAAGGAATGAACG1600AATGTCCAGCTCCAGACGAGCTGTAGAAACCAAAGAAAACCAAAGACTCA1650GAGCAGTTAGTGATTCACATGATGAACGCTGCCACTGTCAGCACAATGTT1700GTTCAATAGA ACTCACATGC ACAAA该基因序列全长包括5' UTR, 3' UTR和开放阅读框(ORF)。
2. —种权利要求1所述的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶氨基酸序列全长MDLHRAPffKS SAAAAVLLLA LFSGAAASSV EKNLAACLRD NDYDQLLQTV 50QDGLPHINTSNHVVIVGAGVAGLTAAKLLQDAGHRVTIVE ANSRIGGRVE100TYRNKEEGffYADLGAMRIPSDHSIFRffFAKTLGVKLNPFI MDDHNTFYFV150NGLLKRTYTVEANPDILNYKVRSSEKGKSANTLFQDALQK VKDEVEAHGC200RAALMKYDKYSAKEYLKEVAGLSSEALRMI⑶LLNEQSLM YTALSEMIYD250QADVNDNVQYDEVTGGTDLFPRAFLSVLDVPILLNSKVQR IRRSRDGVTV300SFKESQRSSLTDLHADMVLVTTTAKAALYMDFEPSLSIRK MEALRAVHYD350SSTKIILTFSSRFffEEDGIRGGKSITDRPSRYIYYPSHTF PANSSVGVLL400ASYTffSDDSLLLQAASDEELKEMALRDLVKIHGERVRALC TGVVVKKffSL450DPYSFGAFALFTPYQHLEYAKELFRSEGRVHFAGEHTAFP HAWMESAMKS500AIRAATNINKQTLLNEGMNECPAPDEL
3.—种权利要求1，2所述的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因序列的克隆方法，其特征 在于获得权利要求1，2所述的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶ORF的核苷酸序列，所设计的引 物序列如下Sense Primer 5' -GGCTGAAGAAGGCAAAGAAGAAC-3‘ Anti-sense Primer 5' -AACAACATTGTGCTGACAGTGGC-3‘
4.一种权利要求1，2，3所述的黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的用途，该L-氨基酸氧化 酶从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化得到，对刺激隐核虫具有杀灭作用，对代表性革兰氏阳性 菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有杀菌活性。
全文摘要
本发明公开了一种黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶的基因全序列及其用途。黄斑蓝子鱼L-氨基酸氧化酶基因全序列长度为1725bp，开放阅读框长度为1584bp，其具体位置在43-1626区域，编码527个氨基酸。该L-氨基酸氧化酶从黄斑蓝子鱼血清中分离纯化得到，对刺激隐核虫具有杀灭作用，对代表性革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌)具有杀菌活性。在经过优化的高保真酶PCR反应体系中，以黄斑蓝子鱼脾脏总cDNA为模板，采用设计的一对特异性引物，可快速准确克隆出编码该蛋白的基因序列，用于后续基因工程。
文档编号A61K38/44GK102121020SQ20101057787
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月7日 优先权日2010年12月7日
发明者李安兴, 王方华, 黎睿君 申请人:中山大学