专利名称：一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(nvdc-jxa1株)的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及兽用生物制品技术领域，具体地，涉及猪繁殖与呼吸综合征疫苗技术领域，进一步地，涉及一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其应用。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种高度接触性传染病。不同年龄、品种和性别的猪均能感染，但以妊娠母猪和I月龄以内仔猪最易感。该病以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、败血症、高死亡率等为主要特征。高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株引起的一种急性、高致死性传染病，临床表现以体温高、发病率高和死亡率高“三高”为主要特点。2006年夏季，该病(当时称“猪无名高热病”)在我国较大范围流行，使我国养猪业遭受了前所未有的惨重的经济损失。根据基因同源性和血清学差异可将PRRSV分为美洲型和欧洲型，在我国流行的主要是美洲型毒株。由于目前尚无治疗该病的特效药物，因此使用特异性疫苗成为防控PRRS的主要措施。目前国内外已研制出灭活疫苗和弱毒活疫苗两种类型的疫苗，一般认为弱毒活疫苗免疫效果好，而灭活疫苗安全性更佳。灭活疫苗是较早研制的疫苗，使用后主要刺激猪体产生体液免疫反应。因其是死苗，故最大的优点是安全、不散毒、便于储存和运输。Bayer公司于1997年首次推出了灭活疫苗PRRomiSetM，目前我国已有20家企业被农业部批准生产PRRS灭活疫苗=CH-Ia株(哈尔滨维科生物技术开发公司)和NVDC-JXAl株(广东大华农动物保健品股份有限公司等19家)，主要用于PRRS阴性猪场的免疫，对控制PRRS和降低经济损失起到一定的重大。在PRRS灭活疫苗制备过程中，涉及制苗用病毒液的制备工艺，这是疫苗制备的关键点，而这一工艺传统的制备方法是通过转瓶培养细胞的生产方式来实现的，这种生产方式具有以下缺点1)劳动强度大；2)批间差异大；3)细胞密度低，产量低；4)容易污染等。实践证明，仅仅依靠动物细胞通过转瓶培养方式生产病毒的量是有限的。为了克服现有PRRS灭活疫苗生产技术所存在的缺陷，寻找简便、高效的病毒株生长培养条件对提高疫苗质量、降低生产成本具有重大意义。近年来，利用生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。这一技术具有以下优点1)产品批间差异小；2)极大的降低细菌污染的可能性；3)产品质量稳定，免疫副反应低；4)易于放大。如果将这一技术应用于PRRS疫苗的生产，则既保持细胞培养的优势又克服了其生产产量有限的缺点。我国在这方面的研究虽然起步较晚，但近年来研究非常活跃。中国专利公开号为CN101612395A，发明名称为一种培养敏感细胞生产蓝耳病疫苗的方法的中国专利公开了一种在生物反应器中用微载体培养敏感细胞生产猪蓝耳病疫苗的方法，所用的生物反应器为搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、Wave生物反应器和中空纤维反应器，培养方式采用流加培养或灌注培养；专利申请公布号为CN102038942A，发明名称为应用生物反应器工业化生产猪蓝耳病疫苗的方法的中国专利提出一种利用Cell Lift型生物反应器，采用生物反应器间逐级放大的倒罐式操作技术，进行细胞的高密度培养以制备疫苗的方法，所用的生物反应器为搅拌式生物反应器，所述载体为Cytodex系列微载体，采用批式、流加或灌注培养方式；专利申请公布号为CN102002482A，发明名称为猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒毒的生产方法的中国专利则提出一种应用激流-灌注式生物反应器培养Marc-145细胞生产猪蓝耳病病毒的生产工艺，所述载体为聚酯酰胺纸片载体；而专利申请公布号为CN101831412 A，发明名称为一种大规模生产猪蓝耳病病毒的方法的中国专利和专利申请公布号为CN101979514 A，发明名称为猪蓝耳病病毒与疫苗及二者的生产方法的中国专利均提出一种采用潮汐式微载体悬浮培养生物反应器生产猪蓝耳病病毒的方法，所述微载体为片状、球形或网状，成分为聚酯、明胶或多糖，优选的为网状聚酯纤维。而应用搅拌式生物反应器-球形微载体体系培养细胞生产猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)，尚未见报道。

发明内容
为此，本发明提供了一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法及其应用，该方法生产的疫苗，污染机率低，病毒滴度高(其毒价可提高2 5倍)，批间差异小，产品质量稳定，副反应小，能全面提升疫苗质量。本发明的技术方案如下一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAI株)的方法及其应用，包括如下步骤(I)用微载体培养制苗用细胞选择生物反应器；选择球形微载体作为细胞贴附生长的载体；选择Marc-145细胞作为制苗用细胞；将Marc-145细胞经胰酶消化液消化传代，用配方为含7% 10%胎牛血清的DMEM培养基、pH调整为7. 2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层时，取转瓶上生长良好的Marc-145细胞，经胰酶消化液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按每个微载体添加5 20个细胞的比例接种到含有细胞生长液与微载体的生物反应器中；生物反应器设定如下参数温度37°C、pH值6. 8 7. 4、溶氧含量40% 60%、搅拌速度30 55rpm、C02通气量5 10%，进行反应器自动控制培养；(2)制苗用毒液的繁殖与收获培养后48 72小时待观察到微载体上细胞基本长满形成致密单层时，去掉细胞生长液，加入1/4 I工作体积的配方为含2% 5%胎牛血清的DMEM培养基、pH调整为7. 2的细胞维持液；将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株种毒按照感染复数M. 0. I.为0. 0001 I. 0的比例接种生长良好的上述细胞单层，37°C孵育I 10小时，然后向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，并设定如下参数温度37°C、pH值6. 5 7. 2、溶氧40% 60%、搅拌速度30 45rpm、C02通气量5 10%，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔2小时取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，待观察微载体上细胞基本全部脱落、细胞病变达到80%以上时，停止反应器的搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，分别收获上清液和微载体；反复冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，_20°C以下保存作为半成品；按《中国兽药典》附录对半成品进行无菌检验及病毒含量测定，病毒含量应不低于106_°TCID5(l/ml ；(3)疫苗配制将检验合格的病毒液按终浓度为0. 1%比例加入甲醛溶液，混匀，置37°C灭活18小时取出，置2 8°C保存；灭活检验合格后，取灭活病毒液96份，加入高压灭、菌冷却后的吐温-804份，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相。取注射用白油94份、司本-806份混合后加热，再加入硬脂酸铝2份，随加随搅拌到透明为止，高压灭菌，制得油相；取油相I. 5份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入水相I份，加完后再以3000r/min搅拌30 60分钟，使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)；(4)成品检验按农业部审批通过的《猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)制造及检验试行规程》要求进行检验，各项指标均符合规定。所述用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法，步骤(I)中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度等参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为I. 3L 1500L。所述用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法，步骤(I)中，微载体为球形微载体，添加量为2 10g/L，在使用前需清洗、灭菌，方法如下1) 用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30分钟。本发明的有益效果为本发明所述用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法，与传统的转瓶生产工艺相比，具有以下优点(I)应用本发明生产的疫苗，污染机率低，病毒滴度高(其毒价可提高2 5倍)，批间差异小，产品质量稳定，副反应小，能全面提升疫苗质量；(2)自动化程度高，劳动强度小，节省人力，且产量大、占地小、生产周期短，能有效降低生产成本；(3)本发明采用球形微载体作为细胞培养载体，易于快速扩大生产规模，能克服片状载体难于放大的特征。
具体实施例方式实施例I :一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法，步骤如下(I)用微载体培养制苗用细胞选择7. 5L NBS生物反应器，其工作体积为5L ;选择CytodexI球形微载体作为细胞贴附生长的载体，使用量为4g/L培养基，称量CytodexI球形微载体，并对其进行清洗、灭菌，方法为1)用适量PBS浸泡3小时；2)用适量PBS清洗微载体3遍；3)加入适量PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30分钟；选择Marc-145细胞作为制苗用细胞；将Marc-145细胞经胰酶消化液消化传代，用配方为含10%胎牛血清的90%DMEM培养基、PH调整为7. 2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层时，取转瓶上生长良好的Marc-145细胞，经胰酶消化液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按每个微载体添加10个细胞的比例接种到含有细胞生长液与微载体的生物反应器中；生物反应器设定如下参数温度37°C、pH值7. O、溶氧含量50%、搅拌速度45rpm、C02通气量5%，进行反应器自动控制培养；(2)制苗用毒液的繁殖与收获培养后48小时待观察到微载体上细胞基本长满形成致密单层时，去掉细胞生长液，加入1/4 I工作体积的配方为含2%胎牛血清的98%DMEM培养基、PH调整为7. 2的细胞维持液；将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株种毒按照感染复数M.O. I.为0.01的比例接种生长良好的上述细胞单层，37°C孵育4小时，然后向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，并设定如下参数温度37°C、pH值
7.O、溶氧50%、搅拌速度35rpm、C02通气量5%，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔2小时取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，待观察微载体上细胞基本全部脱落、细胞病变达到80%以上时，停止反应器的搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，分别收获上清液和微载体；反复冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，-20°C以下保存作为半成品；按《中国兽药典》附录对半成品进行无菌检验及病毒含量测定；结果共收获病毒液101^无菌检验合格，病毒含量达107_ 5TCID5tZml。
权利要求
1.一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其应用，其特征在于，包括如下步骤 (1)用微载体培养制苗用细胞选择生物反应器；选择球形微载体作为细胞贴附生长的载体；选择Marc-145细胞作为制苗用细胞；将Marc-145细胞经胰酶消化液消化传代，用配方为含7% 10%胎牛血清的DMEM培养基、pH调整为7. 2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好单层时，取转瓶上生长良好的Marc-145细胞，经胰酶消化液消化制备为细胞悬液，细胞计数后按每个微载体添加5 20个细胞的比例接种到含有细胞生长液与微载体的生物反应器中；生物反应器设定如下参数温度37°C、pH值6. 8 7. 4、溶氧含量40% 60%、搅拌速度30 55rpm、C02通气量5 10%，进行反应器自动控制培养； (2)制苗用毒液的繁殖与收获培养后48 72小时待观察到微载体上细胞基本长满形成致密单层时，去掉细胞生长液，加入1/4 I工作体积的配方为含2% 5%胎牛血清的DMEM培养基、pH调整为7. 2的细胞维持液；将猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXAl株种毒按照感染复数M. 0. I.为0. 0001 I. 0的比例接种生长良好的上述细胞单层，37°C孵育I 10小时，然后向生物反应器中补足生物反应器正常工作所需要的培养基，并设定如下参数温度37°C、pH值6. 5 7. 2、溶氧40% 60%、搅拌速度30 45rpm、C02通气量5 10%，进行反应器自动控制培养；接毒后每隔2小时取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，待观察微载体上细胞基本全部脱落、细胞病变达到80%以上时，停止反应器的搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，分别收获上清液和微载体；反复冻融2次，经离心或过滤除去细胞碎片，_20°C以下保存作为半成品；按《中国兽药典》附录对半成品进行无菌检验及病毒含量测定，病毒含量应不低于106_°TCID5(l/ml ； (3)疫苗配制将检验合格的病毒液按终浓度为0.1%比例加入甲醛溶液，混匀，置37°C灭活18小时取出，置2 8°C保存；灭活检验合格后，取灭活病毒液96份，加入高压灭菌冷却后的吐温-80 4份，充分搅拌，直至吐温-80完全溶解，制得水相；取注射用白油94份、司本-80 6份混合后加热，再加入硬脂酸铝2份，随加随搅拌到透明为止，高压灭菌，制得油相；取油相I. 5份置乳化灌中搅拌，再缓慢加入水相I份，加完后再以3000r/min搅拌30 60分钟，使混合物充分乳化，制成猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)； (4)成品检验按农业部审批通过的《猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)制造及检验试行规程》要求进行检验，各项指标均符合规定。
2.如权利要求I所述的用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其应用，其特征在于，步骤(I)中，生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度等参数，适用于微载体培养的生物反应器，容积为I. 3L 1500L。
3.如权利要求I所述的用生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXAl株)的方法及其应用，其特征在于，步骤(I)中，微载体为球形微载体，添加量为2 10g/L，在使用前需清洗、灭菌，方法如下1)用PBS浸泡微载体三小时以上；2)用PBS清洗微载体3遍；3)用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30分钟。
全文摘要
本发明提供了一种生物反应器制备猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)的方法及其应用，包括如下步骤(1)用微载体培养制苗用细胞；选择生物反应器；(2)制苗用毒液的繁殖与收获；(3)疫苗配制；(4)成品检验。该方法生产的疫苗，污染机率低，病毒滴度高(其毒价可提高2～5倍)，批间差异小，产品质量稳定，副反应小，能全面提升疫苗质量。
文档编号A61P31/14GK102727878SQ201210231129
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月4日 优先权日2012年7月4日
发明者周智, 徐家华, 曲萍, 林绮萍, 田克恭, 练炳洲, 翟新验, 遇秀玲, 邓小熊, 陈瑞爱 申请人:中国动物疫病预防控制中心, 广东大华农动物保健品股份有限公司