专利名称：鸡新城疫和h9n2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
新城疫又称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病。新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病死亡率高，对养鸡业危 害严重。1926年首先发现于印度尼西亚，不久又在英国新城发现，世界各国均有流行记载。
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)隶属于正粘病毒科A型流感病毒属，因为该病毒是AIV负链、分节段的RNA病毒，所以该病毒很容易发生变异并不断的突破其感染宿主的种属障碍，引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火鸡体内分离到H9N2亚型AIV以来，该亚型的病毒不断传播，目前已在全世界范围的禽群中广泛存在。我国也于1992年首次报道了鸡群中H9N2亚型AIV的感染，H9N2亚型是目前我国鸡群中存在的AIV主要亚型，占禽流感总发病率的90%以上。H9N2亚型禽流感发病后虽然致死率不高(一般不超过30%),但常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋下降，并使鸡群易继发严重的呼吸道疾病，影响家禽生产性能。AIV不仅对我国的养殖业造成了严重的损失，而且对人类健康也构成了威胁。目前新城疫、H9N2亚型禽流感严重危害家禽养殖业的发展，在各种防控措施中，疫苗的免疫仍为最重要的措施。针对新城疫、H9N2亚型禽流感，已有相应的灭活单苗及二联灭活苗，但是免疫剂量大，抗体水平低，对流行毒株的交叉免疫保护率不高，给免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制出免疫剂量小，交叉免疫效果更好的新城疫、禽流感H9N2亚型二联苗是一项具有重要意义的工作。

发明内容
本发明的目的在于提供一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，该二联灭活疫苗中含有的H9亚型禽流感病毒HN03株，免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长。本发明的另一目的在于提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全。本发明采用如下技术方法来实现发明目的
一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株；所述禽流感病毒 A/chicken/HeNan/03/2009/ (H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，保藏号为CGMCC NO :6258。所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: I 30一种制备所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，包括如下步骤
Cl)病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液；
(2)病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液；
(3)水相制备将鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液混合，获得混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80混合，制得水相；
(4)油相制备将注射用白油和司本一80混匀，作为油相；
(5)乳化将水相和油相混合均匀，即得鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗。步骤(2)中，所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3X108_° EID5tl 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亚型禽流感病毒HNO3株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后禽流感Η9病毒液中病毒含量为3Χ IO8'0 EID50 3 XlO8- 5EID500所述步骤(2)中各灭活病毒液中β -丙内酯的体积百分数为O. 04% O. 06%。步骤(3)中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液与Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株灭活病毒液的体积比为2:1 3 ;步骤(3)中所述混合病毒液与吐温_80混合的体积比为96 4。步骤(4)中所述注射用白油和司本一 80混合的体积比为94 6。步骤(5)所述水相和油相混合的体积比为1:3。有益效果
本发明鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗中含有的Η9亚型禽流感病毒ΗΝ03株，是发明人自行分离、筛选、鉴定的，该毒株免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的Η9Ν2亚型禽流感病毒SHOl、Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够使接种对象产生高水平的抗体，持续期长，不仅能够抵抗Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的Η9Ν2亚型禽流感病毒SH01、Η9Ν2亚型禽流感病毒JX02攻毒。本发明制备鸡新城疫和Η9Ν2亚型禽流感二联灭活疫苗的方法，简单，安全。因为制备方法中对病毒液进行了浓缩，所以提高单位体积疫苗中的抗原含量，有效降低了使用剂量，成年鸡由原来免疫剂量O. 5ml/羽降到O. 3ml/羽，达到同样的免疫效果；使用了使用了丙内酯作为灭活剂，使产品中不含甲醛，确保受免动物体内无甲醛残留，提高畜产品的品质。
具体实施例方式实例I Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株的分离与鉴定
I.病料
病料为无菌采集死亡病鸡的心血、肝、脑、肺组织。
2.组织触片
将病料作心血涂片及各脏器的病毒组织触片，并进行染色镜检，发现病毒组织触片染色镜检结果为阴性。3.细菌培养
将上述病料，分别用马丁肉汤和绵羊血培养基培养(按现行《中国兽药典》附录方法配制)，结果显示无菌落生长，说明所述病料中不含有细菌。4.病料处理
将上述病料在无菌容器中剪碎、磨碎，用含青链霉素的灭菌生理盐水(每毫升生理盐水含2000单位的青霉素和2000单位的链霉素)作I : 5倍稀释，反复冻融三次后，3000r/min离心20分钟，取上清液保存于_20°C备用。 5.病毒分离、接种及收获
将本实施例标题4中获得的上清液，尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每胚接种量
O.2ml，接种后置37°C条件孵化。接种24小时以内死亡胚弃去，收获24小时以后死亡鸡胚尿囊液，测定尿囊液红细胞凝集价，将红细胞凝集价不低于I : 64的尿囊液置-20°C保存，为鸡胚扩繁的第一代种毒，简称El代种毒。将El代种毒继续传3代，即为E4代种毒，用于病毒生物学特性鉴定。红细胞凝集价采用红细胞凝集试验(微量法)进行检测，具体方法如下在96孔(角度为110° )微量板上，从第I孔至12孔，每孔加入生理盐水30 μ 1，用加液器吸取含毒尿囊液30 μ 1，从每排第I孔起，依次作倍比稀释，至11孔，弃去加液器内30 μ I液体，最后I个孔不加作为空白对照。每孔加入1%鸡红细胞悬液30 μ 1，立即在微量振荡器上摇匀，置20°C室温，20分钟后观察结果，使红细胞完全凝集的最高稀释度，作为判定终点。结果表明El代种毒的红细胞凝集价为I : 256，E4代种毒的红细胞凝集价为I : 1024。6.血凝抑制试验
将E4代种毒用灭菌生理盐水作I : 256稀释，即为4个血凝单位抗原。分别用购自中国兽医药品监察所的鸡新城疫、鸡产蛋下降综合征、禽流感(H9)、禽流感(H5)标准阳性血清进行血凝抑制试验(参照现行《中国兽药典》中方法)，结果显示被检E4代种毒只可被禽流感(H9)标准阳性血清抑制，其它三种血清均不能抑制，初步说明本株病毒为H9亚型禽流感病毒。7.病毒含量测定
将E4代种毒10倍倍比稀释，取10_7、10_8、10_9三个稀释度，分别通过尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚O. 1ml，置37°C孵育120小时。120小时后，逐胚测定红细胞凝集价(方法同前)，以红细胞凝集价不低于I : 16判为感染，按Reed-Muench方法计算病毒含量。结果表明E4代种毒的病毒含量为108 5EID5(i/0. Iml08.静脉致病指数(IVPI)测定
参照二 000年版《中华人民共和国兽用生物制品规程》(以下简称《规程》)附录448页方法进行。结果表明E4代种毒的静脉致病指数为0，表明该毒株为低致病禽流感H9亚型病毒。9.鸡胚最小致死量的平均死亡时间(MDT/MLD)测定
按《规程》附录447页方法进行。结果表明E4代种毒的鸡胚最小致死量的平均死亡时间为81. 5小时/10'10.免疫原性测定
将E4代种毒按常规方法制成含量为108_°EID5(i/0. 3ml的灭活疫苗。按O. 2ml/羽份免疫I月龄SPF鸡10只，另取5只不免疫，作为空白对照。免疫21天后，所有试验鸡采血，分离血清，参照现行《中国兽药典》中方法进行血凝抑制试验。同时对免疫组和对照组进行攻毒，静脉注射E4代种毒IO5 tlEID5tl/只，免疫后第5天逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物，过滤除菌，接种9 10日龄SPF鸡胚，每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚，O. 2ml/胚。37°C孵育120小时，测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于I : 16 (微量法)则判为感染。对病毒感染为阴性的鸡胚，应盲传一次。结果表明 ，该疫苗按照O. 2ml/羽份剂量免疫后21天，免疫组血清中E4代种毒血凝抑制抗体水平不低于I 128 (微量法)，空白对照组均不高于I : 4 (微量法)，免疫攻毒保护试验结果表明，免疫组10/10病毒分离为阴性，对照组5/5病毒分离为阳性。11.血凝素HA基因及神经氨酸酶NA基因鉴定
由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室进行，鉴定结果为E4代种毒的HA基因(如SEQ ID NO: I所示)属于A型流感病毒H9亚型，NA基因(如SEQ ID NO: 2所示)属于A型流感病毒N2亚型。因此，将该毒株命名为禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。将E4代种毒进行保藏。保藏信息如下
保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。分类命名禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株。保藏号CGMCCNO :6258。保藏日期2012年7月2日。为了方便描述，将禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。12.对流行毒株的交叉攻毒保护性研究 A/Chinken/Shanghai/01/2011/ (H9N2)(简称 H9N2 亚型禽流感病毒 SHOl )，由上海兽
医研究所2011年于上海分离。A/Chinken/Jiaxing/02/2011/ (H9N2)(简称H9N2亚型禽流感病毒JX02)由南京天邦公司生物技术研究所2011年于浙江嘉兴分离。将H9N2亚型禽流感病毒HN03株按常规方法制成病毒含量为108_°EID5(i/0. 3ml的灭活疫苗，免疫I月龄SPF鸡30只；另取15只I月龄SPF鸡，分为3组，5只/组，不免疫作为空白对照组。免疫后21天，将免疫组随机分成三组，其中一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒HN03株尿囊液攻毒，另一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒SHOl尿囊液攻毒，剩余的一组静脉注射H9N2亚型禽流感病毒JX02尿囊液攻毒；3个空白对照组的攻毒方法同免疫组。攻毒后第5天，逐只用棉拭子采集鸡喉头分泌物，过滤除菌，接种扩10日龄SPF鸡胚，每个样品尿囊腔接种5枚鸡胚，O. 2ml/胚。37°C孵育120小时，测定尿囊液红细胞凝集价。5枚鸡胚中只要有I枚鸡胚的鸡胚液的红细胞凝集价不低于I : 16 (微量法)则判为感染。对病毒分离阴性的样品，肓传一代。结果表明H9N2亚型禽流感病毒HN03株对同源毒及非同源毒保护率均为100%，表明该毒株不但可以针对同源毒提供良好保护，对2011新分离的流行毒株也同样具有良好的保护性。H9N2亚型禽流感病毒HN03株生物学特性研究结果表明，该毒株可在鸡胚中高滴度增殖，血凝效价较高，为I : 1024(微量法)，免疫原性好，能完全抵抗同源病毒攻击，异源攻毒保护率也高达100%。因此可作为H9N2亚型禽流感疫苗候选毒株，用于制备灭活疫苗。
实施例2鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的制备
I.制苗用毒种来源
制造本品用的毒种为鸡新城疫病毒La Sota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株 CGMCC NO :6258,其中禽流感病毒 A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株。
鸡新城疫病毒La Sota株(中国兽医药品监察所菌毒种编号CVCC AV1615株)购自中国兽医药品监察所，H9N2亚型禽流感病毒HN03株由国家兽用生物制品工程技术研究中心按照实施例I方法分离，经哈尔滨兽医研究所鉴定，提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。2.病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液；
(I)鸡新城疫病毒La Sota株病毒液的制备将鸡新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液。具体方法如下
接种取鸡新城疫病毒La Sota株，用灭菌生理盐水作适当稀释(如10_4或10_5)，尿囊腔内接种9 10日龄SPF鸡胚，每胚O. 1ml，接种后密封针孔，置36 37°C继续孵育，不必翻蛋。孵育和观察鸡胚接种后，每日照蛋I次，将60小时以前死亡的鸡胚弃去。此后，每Γ8小时照蛋I次，死亡的鸡胚随时弃去。当孵育时间达到96或120小时，不论死亡与否，全部收回，气室向上，置于2 8°C冷却12 24小时。收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部位卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液作为鸡新城疫病毒LaSota株病毒液。在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入适宜抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位)，每组抽样测定红细胞凝集价，红细胞凝集价低于I 512 (微量法)者应弃之，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。注意在吸取胚液前，对每个鸡胚均应注意检查，凡出现腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获。(2)H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液的制备将H9N2亚型禽流感病毒HN03株接种SPF鸡胚，收获鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液。具体方法如下
接种将H9N2亚型禽流感病毒HN03株用灭菌生理盐水作I : 5000稀释，尿囊腔内接种9 11日龄SPF鸡胚，每胚O. 1ml，接种后密封针孔，置36 37°C继续孵育，不必翻蛋。
孵育和观察鸡胚接种后，24小时内照蛋I次，弃去死胚。此后，每4 8小时照蛋I次。当孵育时间达到96 120小时，随时收回死亡的鸡胚，气室向上，置2 8°C冷却4 24小时。收获将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌手术剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液作为H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液。在鸡新城疫病毒La Sota株病毒液中，加入适宜抗生素(每毫升抗原中青霉素终浓度800单位，链霉素终浓度800单位)，每组抽样测定红细胞凝集价，红细胞凝集价低于I 256 (微量法)者弃去，同时按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。注意在吸取胚液前对每个鸡胚均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液浑浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和活胚分别收获。每若干枚鸡胚的胚液分为一组。3.病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感 病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入β-丙内酯获得灭活病毒液。各灭活病毒液中β -丙内酯的体积百分数为O. 04% O. 06%ο所述鸡新城疫病毒La Sota株病毒液浓缩至每O. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3Χ 108_° EID50 3Χ IO9 tlEID5tl ;所述Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株病毒液浓缩至每O. I毫升浓缩后禽流感Η9病毒液中病毒含量为3XlO8 tl EID5tl 3Χ IO8 5EID5tlt5 —般来说，浓缩至原体积的1/2 1/4，即能达到要求。(I)病毒液的浓缩
将鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和Η9Ν2亚型禽流感病毒ΗΝ03株病毒液分别连续离心澄清(连续离心转速10000转/秒)，除去病毒液中的大颗粒，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统(购自美国Millipore公司，超滤膜孔径300KD)分别将上述病毒液滤浓至原体积的1/3，获得浓缩病毒液。用超滤浓缩过程中产生的滤出废液接种鸡胚，均应无血凝性，且不引起鸡胚死亡。(2)病毒液的灭活
将上述两种浓缩病毒液分别置无菌灭活罐内，加入β -丙内酯溶液，随加随搅拌，使其充分混合。加完丙内酯溶液后用无菌压缩空气将其压入另一无菌灭活罐内，置4°C下灭活24小时，期间每隔4小时搅拌I次，即获得灭活病毒液。灭活病毒液中β-丙内酯的体积百分数为0.05%。从灭活病毒液中取样进行灭活检验。灭活病毒液置2 8°C保存。4.半成品检验
(I)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。(2)病毒含量测定
鸡新城疫病毒La Sota株浓缩病毒液的含量测定将浓缩病毒液作3倍稀释后,测病毒含量。每O. Iml稀释后的浓缩病毒液中病毒含量为108_° 109_°EID5(I,所以每O. Iml浓缩病毒液中病毒含量为3X108_° EID50 3X IO9 tlEID5tl ;同时进行红细胞凝集价测定(同实施例I )，红细胞凝集价为I : 512 1024 (微量法)。H9N2亚型禽流感病毒HN03株浓缩病毒液的含量测定将浓缩病毒液先作3倍稀释后，测病毒含量，每O. Iml稀释后的浓缩病毒液中病毒含量为108_° IO8 5EID5tl，所以每O. Iml浓缩病毒液中病毒含量为3XlO8 tl EID5tl 3X IO8 5EID5tl ;红细胞凝集价测定，红细胞凝集价(检测方法同实施例I)为I : 512 1024 (微量法)。(3)灭活检验
鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液灭活检验取灭活病毒液，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚，每胚O. 2ml，置36 37°C孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察120小时，鸡胚非特异性死亡应不超过I枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现血凝，并盲传I代，测定红细胞凝集价，均应不出现血凝。H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液灭活检验取灭活病毒液，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚6枚，每胚O. 2ml，置36 37°C孵育，弃去24小时内死亡鸡胚，观察120小时，鸡胚非特异性死亡应不超过I枚。对所有胚液分别测定红细胞凝集价，均应不出现血凝，并盲传I代，测定红细胞凝集价，均应不出现血凝。5.鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗的制备
每羽份(O. 3ml)鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗，鸡新城疫病毒La Sota株含量IO8 0EID50 IO9 0EID50, H9N2 亚型禽流感病毒 HN03 株含量 IO8 0EID50 IO8-5EID500(I)油相制备将注射用白油和司本一 80按照体积比为94 6混匀，作为油相。(2)水相制备
将鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液等体积混合制备混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80按照体积比96 4混合，充分搅拌直至吐温-80完全溶解，即得水相溶液。(3)乳化
将油相和水相按照体积比3 I混合，搅拌均匀获得鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗。具体操作步骤如下将3份油相放入乳化罐内，启动乳化罐搅拌机搅拌，同时徐徐加入水相一份，加完后继续搅拌l(Tl5min，打开均质机进出口开关,启动均质机,使乳化液经均质机进入另一罐，如此反复乳化数次(一般6 8次)，乳化后取IOml疫苗，以3000r/min离心15分钟，应不出现分层现象。实施例3鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗双倍剂量接种安全试验
按实施例2制备5批次鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗(批号20100301、20100502、20100603、20110104、20110305)，灭活前鸡新城疫病毒 La Sota 株及禽流感(H9亚型)HN03株抗原含量均为108_°EID5Q/0. 3ml/羽份。考察对象为7日龄SPF鸡(购自北京梅里亚维通实验动物有限公司)和7日龄三黄肉鸡(购自南京石佛寺养鸡场)。各批鸡购回后，适应数天，核实鸡的全身状况和临床疾病情况，剔除弱鸡，选择健康鸡进入试验。对SPF鸡分别双倍剂量(O. 6ml/只)颈部皮下注射五批鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗，每次设I组不接种，作为对照；对三黄肉鸡分别双倍剂量(O. 6ml/只)颈部皮下注射三批鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗，每次设I组不接种，作为对照。接种后观察14天内是否出现由疫苗引起的任何局部和全身反应，接种后14天、28天各随机抽取试验鸡5 10只，剖检注射部位，检查疫苗的吸收情况。结果用双倍剂量鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗对7日龄SPF鸡和7日龄三黄肉鸡进行接种。接种后14日内，未观察到临床异常，采食、饮水正常，健康情况良好，未发现由疫苗引起的任何局部和全身反应，具体见表I。接种后14天，各组取5 10只鸡剖检注射部位，80%以上肉眼可见少量粟粒样大小颗粒未吸收完全；注射后28天剖检，70%以上疫苗已基本吸收，注射部位未见由疫苗接种引起的异常反应，具体见表2。因此，鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗双倍剂量接种是安全的。表I双倍剂量接种鸡新城疫和H9N2禽流感二联灭活疫苗后14天内临床观察结果
权利要求
1.一种鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于含有鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株；所述禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株缩写为H9N2亚型禽流感病毒HN03株，保藏号为CGMCC NO :6258。
2.根据权利要求I所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于所述鸡新城疫病毒La Sota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株的含量比为2: I 3。
3.一种制备权利要求I所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于包括如下步骤 (1)病毒液的制备将鸡新城疫病毒LaSota株和H9N2亚型禽流感病毒HN03株分别接种SPF鸡胚，分别收获鸡胚液，作为鸡新城疫病毒La Sota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液； (2)病毒液的浓缩与灭活将鸡新城疫病毒LaSota株病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液分别浓缩，然后分别加入￠-丙内酯获得鸡新城疫病毒La Sota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液； (3)水相制备将鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液和H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液混合，获得混合病毒液；将混合病毒液与吐温-80混合，制得水相； (4)油相制备将注射用白油和司本一80混匀，作为油相； (5)乳化将水相和油相混合均匀，即得鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗。
4.根据权利要求3所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤(2)中,所述鸡新城疫病毒LaSota株病毒液浓缩至每0. I晕升浓缩后鸡新城疫病毒液中病毒含量为3X 108_° EID50 3X IO9 ciEID5tl ;所述H9N2亚型禽流感病毒HN03株病毒液浓缩至每0. I毫升浓缩后禽流感H9病毒液中病毒含量为3XlO8 tl EID5tl 3X 108 5EID5Q。
5.根据权利要求3或4所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于所述步骤(2)中各灭活病毒液中P -丙内酯的体积百分数为0. 04% 0. 06%。
6.根据权利要求5所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤(3)中所述混合病毒液中鸡新城疫病毒LaSota株灭活病毒液与H9N2亚型禽流感病毒HN03株灭活病毒液的体积比为2:1 3。
7.根据权利要求6所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤(3)中所述混合病毒液与吐温-80混合的体积比为96 4。
8.根据权利要求7所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤(4)中所述注射用白油和司本一80混合的体积比为94 6。
9.根据权利要求8所述鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，其特征在于步骤(5)所述水相和油相混合的体积比为1:3。
全文摘要
本发明提供鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法，涉及生物工程领域。所述二联灭活疫苗，含有鸡新城疫病毒LaSota株和禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株。制备所述疫苗的方法病毒液的制备、浓缩与灭活，水相制备，油相制备，乳化，即得二联灭活疫苗。本发明鸡新城疫和H9N2亚型禽流感二联灭活疫苗，免疫原性好，产生的抗体水平高，不仅能够抵抗同源病毒攻毒，而且能够抵抗2011年以来新流行的H9N2亚型禽流感病毒SH01、H9N2亚型禽流感病毒JX02攻毒；该二联灭活疫苗能够产生高水平的抗体，持续期长；其制备方法简单，安全。
文档编号A61P31/16GK102805864SQ20121032077
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者于漾, 揭鸿英, 朱亚露, 何家惠, 邓碧华, 张小飞, 艾玉春, 刘志凌, 顾巍巍 申请人:江苏省农业科学院