专利名称：猪旋毛虫病疫苗的制备方法
技术领域：
本发明属于生物制剂-疫苗的制备方法，涉及寄生虫病的疫苗制备，即对猪有免疫预防作用的旋毛虫病疫苗的制备方法。
旋毛虫病是人畜共患危害严重的寄生虫病，侵袭100多种动物，发病广泛，我国多地区发生本病。人常因食用旋毛虫病猪肉、犬肉等而发病，西藏六十年代人旋毛虫病有死亡率6.8%的报导。它还给养猪业造成巨大的经济损失，国家已把此病列入必须控制消灭的疾病之一。由于药物治疗不能解决重复感染的问题，为彻底控制消灭本病，只有通过研制疫苗的方法，使猪、犬获得被动免疫，从而逐渐消灭病原，则人旋毛虫病可望灭迹。
国外对猪旋毛虫病疫苗的研究，主要是应用成虫抗原或新生幼虫抗原。WangC.H.etalParasiteImmunol9465，1987;MartiH.P.etal;Vet.Parasitol20237，1986;均采用高速离心法制出三日龄旋毛虫成虫粗抗原与弗氏完全佐剂乳化后免疫小鼠，可诱导89%的减虫率。成虫抗原据报导对雌虫生殖能力的抑制不理想;新生幼虫抗原免疫原性较成虫为优，但在收集上比较困难。成虫在体外培养中的活力及繁殖率均不甚强，因此利用体外培养获取新生幼虫的方法亦未见成功的报导。
为了增强动物对旋毛虫病的免疫机能，本发明研制了成虫和幼虫的混合抗原疫苗，以诱导动物产生抗成虫和抗幼虫的抗体成分，并结合体外培养观察成虫，在雌虫产幼虫之际集取成虫和极少量刚产出的新生幼虫，解决了收集大量新生幼虫的困难。经动物试验，成虫和肌幼虫减虫率可达90%左右，雌虫生殖能力下降90%左右。
本发明方案为以1000～1200条旋毛虫接种于300克左右的健康大白鼠，接种后第七天扑杀取虫，将虫反复洗涤后放入培养皿。培养液组成为1640培养液中加入ATP、肠粘膜组织浸出液，多种氨基酸以及经过处理的猪血清。在37℃、5%CO2条件下培养24小时，观察雌虫子官中孕育了大量幼虫，在即将产虫之际，即收集培养液中全部虫体(正在产虫的雌虫，刚产出的少许新生幼虫和雄虫)。多次洗涤后计数虫体压积，按1∶100(V/V)比例加入PH7.2PBS液，置-30℃保存。将收集的虫体反复冻融十次后，再用超声波粉碎裂解虫体三次，置4℃过夜，以10000rpm低温离心30分钟，上清液即为可溶性抗原。按1∶4.5(V/V)的比例将可溶性抗原用PH7.2PBS稀释，充分振荡混合后，每100ml抗原稀释液加入甲醛0.2ml，充分混合，加入吐温-802ml充分混合，然后按100∶1(V/V)的比例加入硫柳汞溶液，充分混合，制成抗原稀释液备用。胶体磨经消毒预处理后，将白油-司潘佐剂一份倾入胶体磨滤斗内，低速研磨数分钟后，缓慢滴加抗原稀释液一份，滴加完毕后高速胶磨数分钟使其充分乳化，制成油包水苗;再将油包水苗置胶体磨中低速研磨数分钟，缓缓加入含有2%吐温-80的PBS，高速胶磨数分钟，即制成水包油旋毛虫苗，4℃冰箱保存。
由于本发明利用旋毛虫雌虫子宫内孕育大量成熟幼虫即将产虫之际，集取成虫和新生幼虫制苗，使虫苗能诱导产生抗成虫抗体也能诱导产生抗幼虫抗体，集虫方法简单，收效快，节约时间。所制备的虫苗经动物免疫试验，成虫和肌幼虫减虫率可达90%左右，雌虫的生殖能力下降90%左右，在旋毛虫疫区使用该虫苗定期接种动物，大大降低了动物对旋毛虫病的感染率。
实施例1、扑杀继代保存云南、河南旋毛虫的大白鼠，取肠、腰、咬、腿和肋间肌各一克，镜检含虫数，以1000～1200条接种于体重300克左右的健康大白鼠。接种后第七天，扑杀接种鼠，取其小肠，纵向剖开，横切成2-3em肠段，置于特制的装有150目尼龙网筛的不锈钢过滤装置的上方，放在盛有37℃温生理盐水连有收集玻管的玻璃滤斗内，进入37℃恒温箱中过滤收集成虫4小时。
2、收集玻管底部的成虫，反复以温生理盐水洗涤，将洁净不含杂质的成虫放入1640培养液中，培养液中含有经过处理的猪血清，ATP、肠粘膜组织浸出液、多种氨基酸。培养皿置CO2培养箱，37℃，5%CO2条件下培养24小时，镜检培养液中的雌虫子宫内孕育大量的幼虫，且已产出第一条新生幼虫，立即以吸管收集培养液中全部虫体(雌虫、雄虫、少许新生幼虫)，经多次用温生理盐水洗涤，离心后倾去上清液，计数虫体压积为0.1ml，加入10mlPH7.2的PBS液，-30℃低温保存。经多次集虫获得100ml虫体PBS液。
3、将保存于-30℃的虫体PBS液反复冻融10次，再用超声波粉碎裂解虫体三次，置4℃冰箱过夜，然后以10000rpm低温离心30分钟。收集上清液，测定其蛋白含量及抗原效价后低温保存备用。
4、取出低温保存的抗原100ml，按每1ml抗原加入4.5mlPBS的比例(V/V)，加入PH7.2PBS液，充分振荡混合;将稀释为550ml的抗原中加入1.1ml甲醛，充分振荡混合;再加入吐温-8011ml，充分振荡，最后加入1%硫柳汞5.62ml，充分振荡混合，制成经防腐处理的抗原稀释液。
5、依次用70%洒精，5%福尔马林，无菌三蒸水消毒处理胶体磨。白油-司潘佐剂与上述经防腐处理的抗原稀释液按1∶1(V/V)的比例用胶体磨胶磨，制成油包水虫苗;再将制得的油包水虫苗与含2%吐温-80的PH7.2PBS液胶磨，制得水包油虫苗，用疫苗瓶分装后置4℃保存。即完成猪旋毛虫病疫苗的制备。
权利要求
1.猪旋毛虫病疫苗的制备方法，其特征在于用旋毛虫接种大白鼠，七日后扑杀取成虫，将成虫在体外培养液中培养24小时，观察雌虫即将产出幼虫之际，集虫，制作成虫幼虫混合抗原疫苗。
2.根据权利要求1所述猪旋毛虫疫苗的制备方法，其特征在于，所述体外培养液的组成为1640培养液中加入ATP、多种氨基酸、肠粘膜组织浸出液和经过处理的猪血清。
3.根据权利要求1所述猪旋毛虫疫苗的制备方法，其特征在于所述扑杀取成虫的方法中采用了150目尼龙网筛和不锈钢过滤装置，在37℃条件下恒温收集成虫。
4.根据权利要求1所述猪旋毛虫疫苗的制备方法，其特征在于所述成虫幼虫混合抗原疫苗的制备过程中采用了10次冻融和三次超声波裂解的方法。
全文摘要
猪旋毛虫病疫苗的制备方法，在旋毛虫成虫子宫内孕育大量成熟幼虫的时期收集虫体，制备成虫、幼虫混合性抗原。成虫体外培养系用1640培养液中加入ATP、多种氨基酸、经过处理的猪血清。该疫苗诱导动物产生抗旋毛虫成虫抗体和幼虫抗体，经动物试验表明，疫区的免疫猪减虫率可达90％左右。
文档编号A61K39/002GK1081621SQ9210578
公开日1994年2月9日 申请日期1992年7月25日 优先权日1992年7月25日
发明者郭振刚, 何秀珠, 杨中梁 申请人:杭州商学院, 大理市康复医院