专利名称：黄芪皂苷Ⅱ在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药有效成分提取及应用技术领域。具体涉及黄芪皂苷II在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
正常机体中细胞凋亡和细胞增殖总是在严密调控下维持动态平衡，该平衡一旦被打破，将导致许多疾病的发生，由于细胞凋亡功能下降，突变细胞不能被有效地清除，不断堆积形成肿瘤。能诱导凋亡的药物在肿瘤治疗中发挥重要的作用。多药耐药(Mtltidrug Resistance，MDR)是肿瘤细胞由一种药物诱发后，同时对多种结构和功能不同的化疗药物产生交叉耐药的相象。肿瘤MDR的机制异常复杂，是多基因、 多步骤综合作用的结果。除了主要与多药耐药基因(mtltidrug resistance gene, mdrl) 及其编码产物P-糖蛋白(P-glyco-protein，P-gp)所介导的经典机制外，还与凋亡相关基因(如Bcl-2，RaS，P53)等介导的非经典机制密切相关。多药耐药性目前已经成为临床肿瘤化疗失败的主要原因，如何解决这一问题是目前抗肿瘤研究的热点，其中寻找多药耐药性逆转剂或化疗增敏剂(chemosensitizer，⑶)是解决MDR问题的有效手段之一。黄芪是常用的补益类中药，具有补气升阳，益卫固表等功效，临床常用剂型有黄芪注射液，黄芪粗制剂或以黄芪为主的复方。李伟等报道黄芪注射液具有抗心肌缺血及心肌保护作用(黄芪皂苷注射液对心得安诱发心衰犬心脏舒缩功能的影响，中国实验方剂学杂志，2009年12期81-83页)，另外还有报道称其对肾脏、肺有保护作用及抗贫血作用。近年来发现黄芪注射液和参附注射液联合使用有减少化疗药物毒副作用的发生、提高机体免疫功能、提高患者的生存质量的作用(参附注射液联合黄芪注射液对恶性肿瘤化疗毒副作用的影响，山东医药，2009年第8期，89-90页)，刘成军等报道了黄芪注射液对人鼻咽癌CNE2 荷瘤裸鼠移植瘤具有抑制作用，其机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤组织中P53和 Bcl-2蛋白的表达有关(黄芪注射液对人鼻咽癌CNE2荷瘤裸鼠移植瘤具有抑制作用，中草药，2010年第6期，968-970页)。另外，还有谢少茹等报道了黄芪多糖对胃癌细胞的抑制作用及其机制(河北中医，2009年第9期，第137-144页)。我们在前期研究中发现黄芪总苷对小鼠肝癌(HepA)与肉瘤(S180)具有抑瘤作用，并且体外抑制肝癌Hela细胞的生长。以上报道多数采用联合治疗的方式，即使单独使用黄芪注射液、黄芪多糖或黄芪总皂苷进行研究，也因为其成分复杂(黄芪注射液含有多糖类、皂苷类、黄酮类和氨基酸类等成分)、量效关系不明确等原因，均未能指出是何种具体成分发挥了上述治疗作用。关于其中单体化合物的作用，尤其是关于黄芪皂苷类单体的抗肿瘤作用研究仍未见任何报道。 关于黄芪皂苷II，亦没有报道公布其具有上述作用，也未见将其制成抗肿瘤制剂的报道。另外，黄芪总皂苷或者黄芪注射液也由于成分复杂，导致难以对其质量和稳定性进行控制，使其满足现代用药要求。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术不足，提供结构组分确证、量效关系确切的抗肿瘤药物，尤其是用于提供逆转多药耐药而发挥抗肿瘤作用的药物。为此，本发明提供如下技术解决方案。黄芪皂苷II在制备抗肿瘤药物中的应用。黄芪皂苷(Astragaloside，AS) II的结
构如下所述肿瘤为肝癌。肝癌是我国高发的恶性肿瘤，据统计，每年约有13万人死于肝癌，占全世界肝癌年死亡人数的43. %。化疗在预防术后肿瘤复发和转移中发挥着不可替代的作用，但由于多药耐药的存在，使得化疗效果降低或无效，严重影响了病人的预后和生
活质量。所述黄芪皂苷II通过逆转肿瘤细胞的多药耐药性发挥抗肿瘤作用。所述黄芪皂苷II与其他药物同时给药或序贯给药发挥抗肿瘤作用。本发明的有益效果1.本发明提供了量效关系明确、结构组分确证的抗肿瘤药物，为临床抗肿瘤新药的开发奠定了基础；2.本发明提供了逆转多药耐药发挥抗肿瘤作用的药物，为解决化疗药物多药耐药现象提供了新方案。


图1黄芪皂苷薄层色谱图(I VI为分离组分)图2黄芪皂苷HPLC图(Α.混标溶液；B.组分III ；C.组分I ； 1.黄芪皂苷IV ；2.黄芪皂苷II )图3流式细胞仪检测AS II，AS IV对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞凋亡的影响图4流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化(#Ρ < 0. OlVS BEL-7402, η = 3)图5三种化疗药物对BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的杀伤效应图6 AS II、AS IV对 BEL-7402 和 BEL-7402/5-FU 细胞的剂量-效应曲线lanel :BEL_7402 细胞lane2 :BEL_7402/FU 细胞lane3 :BCL-7402/FU+5_FU(0. 025mg/mL)lane4 :BCL-7402/FU+5_FU+ASII(0. 08mg/mL)
lane5 :BCL-7402/FU+5_FU+ASII(0. 16mg/mL)lane6 :BCL-7402/FU+5_FU+ASIV(0. 08mg/mL)lane7 :BCL-7402/FU+5_FU+ASIV(0. 16mg/mL)lane8 :BCL-7402/FU+5_FU+VRP(0. OOlmg/mL))图 7 mdrl 基因的表达(**p < 0. Ol vs BEL-7402/5-FU，η = 3)图8半定量PCR产物的定量分析A. BEL-7402 组B. BEL-7402/FU 组C. BEL-7402/FU+0. 08mg/mL AS II 组D. BEL-7402/FU+0. 16mg/mL AS II 组E. BEL-7402/FU+0. 08mg/mL AS IV组F. BEL-7402/FU+0. 16mg/mL AS IV组G. BEL-7402/FU+0. OOlmg/mLVRP 组图9 P-gp蛋白的免疫组化染色结果(与BEL-7402/5-FU组比较，#为P < 0. Ol η = 5)图10 P-gp蛋白表达的定量分析图11流式细胞仪检测细胞内Rhol23表达率(*p < 0. 05，< 0. 01 vs BEL-7402/5-FU, η = 3)图12 Rho 123荧光表达率分析lanel :BEL_7402 细胞lane2 :BEL_7402/FU 细胞lane3 :BCL-7402/FU+5_fu(0. 025mg/mL)lane4 :BCL_7402/FU+5-fu+ASII(0. 08mg/mL)lane5 :BCL_7402/FU+5-fu+ASII(0. 16mg/mL)lane6 :BCL_7402/FU+5-fu+ASIV(0. 08mg/mL)lane7 :BCL_7402/FU+5-fu+ASIV(0. 16mg/mL)lane8 :BCL_7402/FU+5-fu+VRP(0. OOlmg/mL)图 13 Bcl-2、Bax 基因表达(**p < 0. 01 vs BEL-7402/5-FU，η = 3)图14半定量PCR产物的定量分析
具体实施例方式实施例1黄芪皂苷II和IV的制备1.实验材料1. 1试药黄芪(原产地甘肃，购自国投药业安徽有限公司，批号080623 ；经安徽中医学院药用植物学教研室刘守金教授鉴定为膜荚黄芪)；黄芪皂苷IV标准品(中国药品生物制品检定所，批号0781-200210)；黄芪皂苷II标准品(上海中药标准化研究中心提供，批号07-1015)；硅胶高效G板(青岛海洋化工厂)；柱层析用硅胶(青岛海洋化工集团)；DlOl树脂(天津友昌工贸有限公司)；乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。
1.2 仪器Agilent IlOOSeriesAgilent ChemStationCTG-10 提取器TU-1800SPC紫外可见分光光度计AB135-S电子分析天平RE-52旋转蒸发器ZK-82B真空干燥箱UV-8三用紫外仪2.实验方法2. 1黄芪总皂苷的提取与分离称取黄芪药材^g，置于CTG-10提取器中，用70%乙醇回流提取2次，第1次加10 倍量，第2次加8倍量，每次lh。合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至10升。水饱和的正丁醇(1 1)萃取三次，合并正丁醇部分，回收正丁醇萃取液浓缩至约1L。2. 2黄芪总皂苷的富集与纯化称取DlOl大孔树脂适量，按规定程序处理后装柱，然后用95%的乙醇反复洗脱， 至洗脱液与水(1 幻混合不产生混浊，再用蒸馏水反复洗脱，至无乙醇味，并且树脂柱不再下降时即可。浓缩后的萃取液缓慢加到DlOl树脂柱(7. 5cmX95cm，树脂高度64cm)上， 先以四倍柱体积的蒸馏水洗脱，以除去糖类成分，继以四倍柱体积的70%乙醇洗脱，收集 70%醇洗脱液，置旋转蒸发器上浓缩，水浴蒸干后称重。2.3黄芪皂苷的分离与提取称取300g硅胶装柱(4. 2cmX 100cm，硅胶高度78cm)，将2. 2制备的黄芪总皂苷， 加少量甲醇溶解后装柱，分别以不同比例的乙酸乙酯甲醇(100 25,100 30)洗脱，每 50mL收集一流份，经薄层色谱检测，合并相同部分，浓缩蒸干，称重，依次得组分I 组分VI 部分。2. 4薄层色谱法鉴别黄芪皂苷2.4. 1对照品溶液的制备精密称取黄芪苷II和IV标准品各l.Omg，用ImL甲醇溶解，摇勻，即得黄芪皂苷II 和IV浓度均为Img · mr1的对照品溶液。2. 4. 2供试品溶液的制备精密称取黄芪总皂苷IOmg ；组分I 组分VI 5mg,分别用ImL甲醇溶解，作为供试品溶液。2. 4. 3 TLC 法硅胶高效G板用0. 3mol -L^1NaH2PO4溶液浸泡，115°C活化汕备用。取供试品溶液和对照品溶液各10 μ L，点于薄层板上，以氯仿一甲醇一乙酸乙酯一水(6 3 1 1)放置过夜的下层溶液为展开剂，展距15cm，展开，取出，吹干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置烘箱中105°C加热至斑点显色清晰，同时置紫外光灯(365nm)下检视。2. 5黄芪总皂苷含量测定2. 5. 1对照品溶液的制备
高效液相色谱仪配备示差检测器色谱工作站
湖南省衡阳市药物机械厂北京普析通用仪器有限责任公司 Mettler Toledo 上海青浦沪西仪器厂上海市实验仪器总厂无锡科达仪器厂
精密称取黄芪苷IV标准品5. Omg，置于IOmL的容量瓶中，用无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇勻即得。2. 5. 2标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0. 05，0. 1,0. 2,0. 3,0. 4和0. 5mL，置具塞试管中，加无水乙醇补足体积至0. 5mL，再分别加入8%的香草醛无水乙醇试液0. 5mL和72%的硫酸5. OmL摇勻，立即放入62 °C恒温水浴中，保温20min后，置冷水浴中冷却至室温，于540nm波长处测吸光度。同时以随行试剂作空白。以吸光度⑴为纵坐标，黄芪苷IV的浓度Pg^mr1(X)为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。2. 5. 3供试品溶液的制备精密称取黄芪总皂苷约10mg，置25mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度， 作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液0. 2mL，照标准曲线项下方法处理并测定吸光度。2.6高效液相色谱法2. 6. 1色谱条件色谱柱ZorboxXDB-C8 (4. 6 X 1. 50mm，5 μ m)；流动相乙腈水=34 66 ；柱温:25°C ；示差检测器光学单元温度:32°C ；流速1. Oml · mirT1。2.6. 2对照品溶液的制备取TLC项下的对照品溶液适量，分别加甲醇稀释成浓度为0. 5,0. 25，0. 125,0. 063 和0.03 ^*!!^1对照品溶液。按上述色谱条件，分别进样10 μ L。以峰面积为纵坐标，对照品溶液的质量数(yg)为横坐标，进行线性回归。2. 6. 3供试品溶液的制备与测定精密称取组分I 组分VI各lmg，加ImL甲醇溶解，取20 μ L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，由回归方程计算各组分中黄芪皂苷II和IV的含量。2. 6. 4精密度试验取浓度为0. 125mg · mL—1的对照品溶液，重复进样5次，每次10 μ L，记录峰面积并计算RSD值。2. 6. 5重复性试验取供试品组分I 5份，分别制备各供试品溶液，照上述色谱条件进行测定，记录峰面积并计算RSD值。2.6.6回收率试验精密称取5份组分I，组分III样品1. Omg,分别制备各供试品溶液。其中组分I样品溶液中加入浓度为0. 125mg ^mr1的黄芪皂苷II对照品溶液0. 5mL，组分III样品溶液中加入浓度为0. 125mg .mL-1的黄芪皂苷IV对照品溶液0. 5mL,依法操作，测定，计算加样回收率。3.结果3. 1黄芪总皂苷的富集与纯化DlOl大孔树脂的70%醇洗脱液回收乙醇，蒸干后称重得总黄芪皂苷6. 5g。3. 2黄芪皂苷硅胶柱层析的分离结果见表1表1硅胶柱层析分离的黄芪皂苷组分
权利要求
1.黄芪皂苷II在制备抗肝癌药物中的应用。
2.如权利要求1的应用，所述黄芪皂苷II通过逆转肿瘤细胞的多药耐药性发挥协助抗肝癌作用。
3.如权利要求1的应用，所述黄芪皂苷II与其他药物同时给药或序贯给药发挥抗肝癌作用。
全文摘要
本发明涉及中药有效成分提取及应用技术领域。本发明提供的黄芩皂苷Ⅱ在不同浓度时对两种人肝癌细胞株BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞的增殖具有明显抑制作用，可与其他药物同时给药或序贯给药发挥抗肿瘤作用。本发明提供了量效关系明确、结构组分确证的抗肿瘤药物，为临床抗肿瘤新药的开发奠定了基础；提供了逆转多药耐药发挥抗肿瘤作用的药物，为解决化疗药物多药耐药现象提供了新方案。
文档编号A61P35/00GK102160867SQ20101054790
公开日2011年8月24日 申请日期2010年11月17日 优先权日2010年11月17日
发明者王培培, 许杜娟, 高建 申请人:安徽医科大学第一附属医院