专利名称：丹参酮在治疗血管平滑肌细胞异常增殖疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药丹参提取物丹参酮的用途，特别涉及丹参酮在制备治疗以血管平滑肌细胞异常增殖为主要病理变化特征的疾病的药物中的应用。
背景技术：
丹参系唇形科鼠尾草属植物的根，为常用的活血化瘀中药。其性微寒，味苦、无毒。有活血通经、凉血消肿、除烦清心的功能。丹参有15种成分，它们是丹参酮I(I)、丹参酮IIA(II)、丹参酮IIB(III)、隐丹参酮(IV)、异丹参酮I(V)、异丹参酮IIA(VI)、异隐丹参酮(VII)、羟基丹参酮IIA(VIII)、丹参酸甲酯(IX)、Miltirone(X)、Salviol(XI)、二氢丹参酮I(XII)、丹参新醌甲(XIII)、丹参新醌乙(XIV)和丹参新醌丙(XV)。因此，可用丹参提取丹参酮。
丹参酮制备的药物已在临床上获得了应用，但通常用于扁桃体炎、耳疖、化脓性骨髓炎、烧伤中的金葡萄菌感染的治疗，冠心病的治疗，抗动脉粥样硬化。
中国专利申请99121460.9公开了丹参酮的一种新用途，即在制备治疗肿瘤药物中的应用。
目前，器官移植存活率较低，皮腔内冠脉成形术(PTCA术)后再狭窄率高达30％～50％，这些疾病严重威胁人类健康。研究发现，这些疾病有一个共同的病理特征，即血管平滑肌细胞异常增殖，而现有的抑制血管平滑肌细胞异常增殖的药物有尼群地平、激素(如雄二醇)、胸苷激酶基因等，使用这些药物治疗不仅费用高，而且疗效不明显，尤其是激素对人体的副作用较大。

发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种丹参酮的新用途，即在制备治疗以血管平滑肌细胞异常增殖为主要病理变化特征的疾病的药物中的应用。
为了便于理解本发明，下面以丹参酮IIA的药理试验及结果予以说明。将从丹参中提取的丹参酮IIA用四甲基偶氮唑兰比色法测定细胞线粒体脱氢酶活性，用以评价丹参酮IIA的细胞毒性；在碱性纤维母细胞生长因子诱导的人血管平滑肌细胞增殖模型上，用氢标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法观察该药对DNA合成的影响；用细胞计数法测定该药对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果发现，在无细胞毒性的浓度范围内，丹参酮IIA剂量依赖性的抑制碱性纤维母细胞生长因子诱导的人血管平滑肌细胞DNA的合成，IC50为2.8μmol/L，丹参酮IIA15μmol/L孵育6天，显著抑制细胞增殖(P＜0.05)。
将体外培养的家兔主动脉中膜平滑肌细胞和第三代亚融合的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)用丹参酮IIA作药理试验表明巨噬细胞源性生长因子可明显促进血管平滑肌细胞c-myc基因高表达，丹参酮IIA具有阻止巨噬细胞源性生长因子刺激血管平滑肌细胞的作用，使c-myc基因表达水平下降；丹参酮IIA硫酸钠能明显抑制PASMC由G期进入S期(P＜0.05)，使PASMC增殖细胞核抗原的表达及PDGF-A和B链mRNA的表达均显著降低(P＜0.01)。
丹参酮IIA的上述药理试验及结果提示，丹参酮对生长因子为始因引起的皮腔内冠脉成形术后再狭窄、移植器官动脉硬化、慢性高血压等疾病具有积极的治疗作用。
丹参酮药物的制备取一定量丹参，粉碎后装入索氏提取器，用5～7倍量60～95％乙醇回流，每次3～5小时，共提取2～3次，合并提取液，然后将提取液浓缩、喷雾干燥即可得丹参酮粉末，将丹参酮粉末加入药学上允许的载体或赋形剂和可选的其它成分，即可制备成各种剂型的药物，给药方式有口服和注射。
本发明具有以下有益效果1、发掘了丹参酮的新医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2、丹参酮对血管平滑肌细胞的异常增殖有很强的抑制作用，因而用该物质配制的药物对防治以血管平滑肌细胞异常增殖为主要病理变化特征的疾病有良好的疗效，有利于改变目前国际国内此类疾病有效治疗药物严重缺乏的现状，推动器官移植学与介入治疗学的发展。
3、丹参酮为丹参的提取物，毒副作用小，药理作用强，具有良好的药用前景。
4、丹参来源丰富、价廉，丹参酮的提取工艺简单，因而具有很好的工业化应用前景。
具体实施例方式
下面通过实施例的描述，进一步说明但不限制本发明。
实施例1 丹参酮IIA抑制人血管平滑肌细胞增殖的体外研究将体外培养的人动脉平滑肌细胞分为5组，分别为空白组及不同剂量的丹参酮IIA组，剂量分别为75μmol/L，15μmol/L，3μmol/L，0.6μmol/L。用四甲基偶氮唑兰比色法测定细胞线粒体脱氢酶活性，以评价丹参酮IIA的细胞毒性；在碱性纤维母细胞生长因子诱导的人血管平滑肌细胞增殖模型上，用氢标胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法观察该药对DNA合成的影响；用细胞计数法测定该药对血管平滑肌细胞增殖的影响；用t检验进行统计学处理。
结果发现，75μmol/L剂量组有细胞毒性，在无细胞毒性的其他浓度范围内，丹参酮IIA剂量依赖性的抑制碱性纤维母细胞生长因子诱导的人血管平滑肌细胞DNA的合成，IC50为2.8μmol/L，丹参酮IIA15μmol/L孵育6天，显著抑制细胞增殖(P＜0.05)。
实施例2 丹参酮IIA抑制巨噬细胞源性生长因子刺激血管平滑肌细胞c-myc基因表达的实验研究将体外培养的家兔主动脉中膜平滑肌细胞，5天换液一次，培养15天。再分别用正常对照组培养液(含5％PPS的DMEM，不含生长因子)、阳性刺激组培养液(即Mp-CM，含巨噬细胞源性生长因子)、丹参酮IIA实验组培养液(含20mg/L丹参酮IIA的Mp-CM)培养。48小时后，用含4％(W/V)多聚甲醛、0.1％戊二醛和4％蔗糖的PBS(pH7.4)洗3次，每次10分钟，用DEPC处理过的双蒸水洗1次，然后浸入70％乙醇中保存。将保存的杂交样品用c-myc基因探针进行细胞内原位杂交，显微镜下进行阳性细胞计数。
结果表明，巨噬细胞源性生长因子可明显促进血管平滑肌细胞c-myc基因高表达，丹参酮IIA具有阻止巨噬细胞源性生长因子刺激血管平滑肌细胞的作用，使c-myc基因表达水平下降，表明丹参酮IIA可通过降低c-myc表达而抑制血管平滑肌细胞异常增殖。
实施例3 丹参酮IIA硫酸钠对低氧诱导肺血管平滑肌细胞增殖的影响研究取第三代亚融合的肺动脉平滑肌细胞(PASMC)，按加入培养液的不同分为6组正常对照组(N)、正常加药对照组(N+DS201)、常氧内皮细胞培养液组(NECCM)、NECCM+DS201组、低氧内皮细胞培养液组(HECCM)、HECCM+DS201组。各加药组药物浓度均为5μmol/L。分组培养24小时后，经固定后行免疫细胞化学染色，光镜下由各组随机选取20个阳性PASMC，用TJTY-300型全自动图像分析仪检测胞浆及核内杂交颗粒的平均光密度值(OD值)。取第三代亚融合的PASMC分组继续培养24小时，1g/L胰蛋白酶消化后制备成单细胞悬液。PBS洗涤2次，700ml/L冷乙醇(4℃)固定2小时，碘化吡啶染色30分钟，用FACsort型流式细胞仪(FCM)分析PASMC细胞周期中各期细胞数占细胞总数的百分值。用PDGF-AcDNA片段和PDGF-BcDNA片段作为探针进行细胞原位杂交，并对细胞增殖周期进行分析。对所测得的数据用t检验进行统计学处理。
结果发现，丹参酮IIA硫酸钠能明显抑制PASMC由G期进入S期(P＜0.05)，使PASMC增殖细胞核抗原的表达及PDGF-A和B链mRNA的表达均显著降低(P＜0.01)。提示，丹参酮IIA硫酸钠可能通过下调PDGFmRNA基因表达而有效抑制HECCM诱导的PASMC增殖。
权利要求
1.丹参酮在制备治疗以血管平滑肌细胞异常增殖为主要病理变化特征的疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于以血管平滑肌细胞异常增殖为主要病理变化特征的疾病包括皮腔内冠脉成形术后再狭窄、移植器官动脉硬化、慢性高血压。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于丹参酮为丹参酮IIA。
全文摘要
本发明涉及丹参酮在制备治疗以血管平滑肌细胞异常增殖为主要病理变化特征的疾病的药物中的应用。药理试验表明，在无细胞毒性的浓度范围内，丹参酮IIA剂量依赖性的抑制碱性纤维母细胞生长因子诱导的人血管平滑肌细胞DNA的合成，IC50为2.8μmol/L，丹参酮IIA15mol/L孵育6天，显著抑制细胞增殖(P＜0.05)。上述药理试验提示，丹参酮对生长因子为始因引起的皮腔内冠脉成形术后再狭窄、移植器官动脉硬化、慢性高血压等疾病具有积极治疗作用。
文档编号A61K31/343GK1489999SQ0213391
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月18日 优先权日2002年10月18日
发明者杜俊蓉 申请人:四川大学