专利名称：：肝素复合物及其制备方法与应用的制作方法肝素复合物及其制备方法与应用
技术领域：
：本发明涉及一种肝素复合物及其制备方法与应用，尤其涉及一种共价接枝肝素复合物及其制备方法与应用。
背景技术：
：肝素(h印arin)是一种阴离子粘多糖，具有抗凝血抗血栓活性Kwon0H，NhoYCetal.Biocompatiblesurfacesbyimmobilizationofheparinondi咖ond-likecarbonfilmsdepositedonvarioussubstrates.Surf.InterfaceAnal.2000，29:386L低分子肝素(L丽H)是由肝素经降解得到低分子量的肝素片段或经分级法得到的低分子量肝素组分，相对分子质量范围一般在30008000，临床上主要用于预防和治疗血栓栓塞性疾病。肝素共价接枝到材料上形成的复合物具有诸多优点，如可以达到肝素固定化的目的，有效防止肝素在用药部位被血流带走。同时，复合物具有生物相容性和抗凝血性。近年来已有大量的共价接枝肝素的复合物合成出来，如聚氨基甲酸酯-PEO-肝素，这些材料显示了较好的物化特性。有报道肝素随着大分子表面的聚乙烯氧化物(PE0)亲水间隔臂的长度的增加，其抗凝活性而增加。但目前制备的肝素复合物安全性、稳定性和对蛋白药物的载药能力仍不够理想。
发明内容本发明要解决的技术问题是针对现有肝素复合物的不足之处，提供一种肝素复合物，其作为药物载体或药用辅料具备更好稳定性、安全性和载药能力。本发明要解决的另一个技术问题是要提供一种具备更好稳定性、耐压性和载药能力的肝素复合物的制备方法。本发明另一个目的是开发肝素与泊洛沙姆合成的新复合物在医药和生物学领域的应用。为解决上述技术问题，本发明采用了以下的技术方案—种肝素与泊洛沙姆形成的复合物具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y其中X为泊洛沙姆，g为间臂分子，Y为肝素，X、g、Y或者X、Y通过共价键结合。上述的泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩a-氢-"羟聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，结构式为H0(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c为2150，b为1567。上述的肝素包括重组肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素盐、低分子量肝素及其盐、能与泊洛沙姆及其衍生物的官能团反应的化学改性肝素和类肝素分子及其盐类。上述的低分子肝素包括但不局限于低分子肝素钠、低分子肝素钙、依诺肝素，替地肝素。上述的间臂分子g是指任何用来连接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子结构，其中大分子为合成高聚物或生物高聚物，包括聚己内酯、聚乙二醇、多糖、蛋白质，小分子是指含有氨基和/或羧基官能团，能够与肝素分子内的羧基或氨基反应的小分子，包括乙二胺。—种肝素复合物的制备方法，利用泊洛沙姆的末端羟基和肝素分子内的羧基或氨基的活性基团反应得到所述肝素复合物，该反应过程为泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端羧酸化，而后与肝素的氨基反应；或者泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端氨基化，而后与肝素的羧基反应。—种肝素复合物的应用，该肝素复合物作为药用辅料或递送载体应用。上述的该复合物作为药用辅料是指上述的该复合物用来制备水溶液分散体，包括乳剂、脂质体、胶束、微粒；或作为长循环、温度或ra敏感性的药物载体材料应用。上述的该复合物作为递送载体应用是指上述的该复合物可以作为与肝素相亲的化学物质、酶或大分子蛋白，包括成纤维细胞生长因子的递送载体。上述的该复合物形成的制剂或材料应用于口服、注射、经皮、粘膜给药系统中或外科、植入手术中。具体实施方式泊洛沙姆(poloxamer)，商品名为pluronic，是白色或微黄色半透明蜡状固体，用作表面活性剂、乳化剂、栓剂基质、赋形剂等。泊洛沙姆因有防止溶血作用，可以用于静脉注射，对某些药物可以起到助溶作用。利用泊洛沙姆和肝素直接或间接地共价结合，并作为载体材料制成相应的制剂，可以达到抗凝血、抗血栓和缓释药物的目的。本发明的肝素与泊洛沙姆形成的复合物具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y其中X为泊洛沙姆，g为间臂分子，Y为肝素，X、g、Y或者X、Y通过共价键结合。上述的泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，S卩a-氢-"羟聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，结构式为HO(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c为2150，b为1567。上述的肝素包括重组肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素盐、低分子量肝素及其盐、能与泊洛沙姆及其衍生物的官能团反应的化学改性肝素和类肝素分子及其盐类。上述的低分子肝素包括但不局限于低分子肝素钠、低分子肝素钙、依诺肝素，替地肝素。上述的间臂分子g是指任何用来连接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子结构，其中大分子为合成高聚物或生物高聚物，包括聚己内酯、聚乙二醇、多糖、蛋白质，小分子是指含有氨基和/或羧基官能团，能够与肝素分子内的羧基或氨基反应的小分子，包括乙二胺。肝素接枝到泊洛沙姆形成复合物的制备方法是利用了泊洛沙姆的末端羟基和肝素分子内的羧基或氨基的活性基团。可以是泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端羧酸化，而后与肝素的氨基反应；也可以是泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端氨基化，而后与肝素的羧基反应。具体反应过程如下a.泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端羧酸化，而后与肝素的氨基反应—定量的泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆、丁二酐、4-二甲基氨基吡啶、三乙胺，置于二氧六环中，搅拌反应过夜，所得反应物的末端为羧基。利用EDC/NHS方法，加入一定量的肝素，搅拌反应24h，然后透析3天，透析袋内溶液经过冷冻干燥得到肝素与泊洛沙姆形成的复合物冻干固体。b.泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端氨基化，而后与肝素的羧基反应—定量的泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆在三乙胺催化下与乙二胺反应，得末端为氨基的产物，然后利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法与肝素的羧基进行反应，可得肝素与泊洛沙姆形成的复合物。上述的该复合物作为药用辅料或递送载体应用，亦在以抗凝血、抗血栓为目的医学和生物学中应用。作为药用辅料时，上述的该复合物用来制备水溶液分散体，包括乳剂、脂质体、胶束、微粒；或作为长循环、温度或ra敏感性的药物载体材料应用。上述的复合物结合与肝素相亲的化学物质、酶或大分子蛋白，包括成纤维细胞生长因子，达到分离这些化学物质或蛋白的目的，亦可以作为运送载体与这些化学物质或蛋白制成缓释制剂，达到缓慢释放的目的。上述的该复合物作为涂层剂应用于人造器官或医疗器械的表面改性。上述的该复合物形成的制剂或材料应用于口服、注射、经皮、粘膜给药系统或外科、植入手术中。以下从几个具体实施例进一步说明本发明。实施例一、低分子肝素_泊洛沙姆的合成与其体外抗凝血实验1-1.低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素的合成称取泊洛沙姆407(相对分子量M=12000，其中a=c=101，b=56)12g，于一圆底烧瓶中，加入2mmo1的丁二酐、2mmo1的4-二甲基氨基吡啶及0.55ml三乙胺，并溶解于200ml二氧六环中，搅拌反应24h得末端为羧基的泊洛沙姆，以其为反应物，利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，加入10g的低分子肝素钠，搅拌反应24h。反应产物经透析袋透析3天，所得产物通过冷冻干燥得到固体粉末，即为低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素。1-2.低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素的体外抗凝血实验运用下面的玻片法，测定不同浓度低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液的体外抗凝血时间，同法操作以0.lg/ml低分子肝素、生理盐水分别为阳性对照和空白对照。含有0.66g/ml、0.44g/ml、0.22g/ml的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液分别为高、中、低三个浓度分组。玻片法分别用含有高、中、低浓度的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素溶液以及低分子肝素和生理盐水浸泡干净的载玻片，取出晾干。用毛细玻管将Wistar大鼠做眼眶内眦取血，迅速滴血于载玻片上，血滴直径约510mm，立即开始记时，此后每隔30s用干燥洁净针头挑动血液1次至针头能挑起纤维蛋白丝为止，即为凝血时间。实验结果如下5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>对照空白组和阳性组结果，表明低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素复合物保留了肝素的抗凝血效果。实施例二、低分子肝素_泊洛沙姆复合物胶束的制备取上述制备的低分子肝素_泊洛沙姆_低分子肝素50mg，分散于20ml蒸馏水中，在37t:下超声处理2min，形成胶束混悬液，然后冷冻干燥，制成固体冻干品，通过实施例一的体外抗凝血实验观察，低分子肝素-泊洛沙姆复合物胶束具有抗凝血作用，可以单用或作为药用辅料应用于溶栓制剂中。实施例三依诺肝素-聚己内酯-泊洛沙姆的合成与酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)缓释脂质体的制备3-1.依诺肝素_聚己内酯_泊洛沙姆_聚己内酯_依诺肝素的合成泊洛沙姆188(M=8350，a=c=80，b=27)2,1与3ml己内酯在Sn-Oct为催化剂、Ar气保护下真空状态进行聚合，搅拌24h后停止反应，反应产物以10ml氯仿溶解，加入10倍量体积的乙醚沉淀，过滤，重复两次以纯化所得产物。将产物在4mmo1丁二酐(SA)、2mmo14-二甲基氨基吡啶(DMAP)、0.55ml三乙胺(TEA)，30ml二氧六环为溶剂下搅拌反应24小时，以10ml氯仿溶解，加入10倍量体积的乙醚沉淀，过滤，重复两次以纯化所得产物。利用1-乙基-3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，所得产物与依诺肝素反应，搅拌反应24h，反应最终产物经透析袋透析3天，最后透析袋内溶液通过冷冻干燥得到固体粉末，即依诺肝素_聚己内酯_泊洛沙姆_聚己内酯_依诺肝素。3-2.载aFGF缓释脂质体的制备取一定量上述制备的依诺肝素_聚己内酯_泊洛沙姆_聚己内酯_依诺肝素，卵磷脂、胆固醇按2:10:l溶解在氯仿中，搅匀，真空干燥，将所得粉末与10ml左右80IU/ml的aFGF水溶液混合，加入1.2mg聚山梨酯80，50rmin-l搅拌2h，制成载有aFGF的脂质体。载有aFGF的脂质体通过公式包封率WX二(Ct-CL)/CtX100%计算，包封率平均值达65%，体外释放实验表明载有aFGF的脂质体，没有突释现象，12小时内的释放量要求达到90%，具有较好的缓释效果。实施例四、替地肝素_乙二胺_泊洛沙姆的合成及其作为药用辅料的应用1、替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆的合成泊洛沙姆338(M=15000，a=c=141，b=44)15g，在100ml二氯甲烷为溶剂，0.6ml三乙胺做催化剂作用下与2mmo1的Cl6'-0^j^N02室温下反应4h，然后，加入2.5mmo1乙二胺，继续反应12h，反应的产物为末端氨基，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亚胺(EDC)/N-羟基于二酰亚胺(NHS)方法，将其与10g依诺肝素的羧基反应，搅拌反应24h，反应最终产物经透析袋透析3天，冷冻干燥，即得形成新材料为替地肝素_乙二胺-泊洛沙姆。2、含替地肝素-乙二胺-泊洛沙姆的维生素E乳膏的制备2.1处方维生素E20g、十八醇6g、单甘酯6g、液体石蜡3g、甘油4g、十二烷基硫酸钠0.7g、尿囊素0.5g、低分子肝素-泊洛沙姆(57IU/mg)10g、氮酮1.Og、尼铂金乙脂0.05g，蒸馏水50ml，制备乳膏总量100g2.2制备方法取处方量的十八醇、单甘酯、液体石蜡、尼铂金乙脂加热至7(TC融化后为油相备用；取甘油、十二烷基硫酸钠、尿囊素加入到蒸馏水中，加热至7(TC溶解后为水相，过滤，将油相加入到水相中，混合搅拌，待温度降至55t:以下时，加入低分子肝素-泊洛沙姆、氮酮、维生素E，继续搅拌至均匀，得到含低分子肝素-泊洛沙姆的维生素E乳膏。此制剂中，低分子肝素_泊洛沙姆作为新型药用辅料，既具有表面活性剂的作用，又起到固定缓释肝素的作用。在上述实施例中，仅对本发明进行了示范性描述，但是本领域技术人员在阅读本专利申请后可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本发明进行各种修改。权利要求一种肝素复合物，其特征在于具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y；其中X为泊洛沙姆，g为间臂分子，Y为肝素，X、g、Y或者X、Y通过共价键结合。2.根据权利要求1所述的肝素复合物，其特征在于所述的泊洛沙姆为聚氧乙烯聚氧丙烯醚，g卩a-氢-"羟聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b-聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，结构式为H0(CH2CH20)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)c，在共聚物中，a和c为2150，b为1567。3.根据权利要求1所述的肝素复合物，其特征在于所述的肝素包括重组肝素、天然肝素、衍生肝素、肝素盐、低分子量肝素及其盐、能与泊洛沙姆及其衍生物的官能团反应的化学改性肝素和类肝素分子及其盐类。4.根据权利要求3所述的肝素复合物，其特征在于所述的低分子肝素包括低分子肝素钠、低分子肝素钙、依诺肝素，替地肝素。5.根据权利要求1所述的肝素复合物，其特征在于所述的间臂分子g是指任何用来连接肝素和泊洛沙姆的大分子或小分子结构，其中大分子为合成高聚物或生物高聚物，包括聚己内酯、聚乙二醇、多糖、蛋白质，小分子是指含有氨基和/或羧基官能团，能够与肝素分子内的羧基或氨基反应的小分子，包括乙二胺。6.根据权利要求1至5任一项所述的肝素复合物的制备方法，其特征在于利用泊洛沙姆的末端羟基和肝素分子内的羧基或氨基的活性基团反应得到所述肝素复合物，该反应过程为泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端羧酸化，而后与肝素的氨基反应；或者泊洛沙姆或连有间臂分子的泊洛沙姆羟基末端氨基化，而后与肝素的羧基反应。7.根据权利要求1至5任一项所述的肝素复合物的应用，其特征在于该肝素复合物作为药用辅料或递送载体应用。8.根据权利要求7所述的肝素复合物的应用，其特征在于该肝素复合物作为药用辅料的应用包括该复合物用来制备水溶液分散体，包括乳剂、脂质体、胶束、微粒；或作为长循环、温度或ra敏感性的药物载体材料应用。9.如权利要求7所述的肝素复合物的应用，其特征在于该肝素复合物可以作为与肝素相亲的化学物质、酶或大分子蛋白的递送载体。10.根据权利要求89所述的肝素复合物的应用，其特征在于该肝素复合物形成的制剂或材料应用于口服、注射、经皮、粘膜给药系统中或外科、植入手术中。全文摘要本发明涉及一种肝素复合物，该肝素复合物具有以下通式Y-X-Y或Y-g-X-g-Y或X-Y或X-g-Y，其中X为泊洛沙姆，g为间臂分子，Y为肝素，X、g、Y或者X、Y通过共价键结合。本发明还提供该肝素复合物的制备方法。该肝素复合物可作为药用辅料或运送载体应用。文档编号A61K9/107GK101766819SQ20091010493公开日2010年7月7日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者周志彩,唐琴琴,张翼,徐艳艳,李校堃,田吉来,赵应征,靳卓,高慧升,鲁翠涛申请人:温州医学院