专利名称：表达禽脑脊髓炎病毒vp1蛋白重组菌的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及表达禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白重组菌的构建，属于分子生物学领域， 也属于兽用生物制品领域。
背景技术：
禽脑脊髓炎又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis Virus, AEV)引起的一种主要侵害雏鸡的传染病，其特征性病理变化为非化脓性脑脊髓炎， 典型症状为运动失调，头颈震颤和渐进性麻痹(赵振华、禹旺盛、郝宪谱等.禽脑脊髓炎的发生与诊断.内蒙古畜牧科学.1994，3 :34-37)。世界几乎所有饲养商品鸡的地区都发生过该病，我国自上世纪80年代以来各地陆续暴发此病，给养禽业带来较大的经济损失。由于本病具有突然出现，难以预测持续期，可通过水平接触和垂直传播等特点，所以对养禽业的危害非常严重，唯一有效办法是通过对产蛋种鸡接种疫苗来预防后代雏鸡的发病。目前国内对禽脑脊髓炎疫苗的研究大多集中在灭活疫苗的研制，国外为弱毒活疫苗的研究报道。AEV是小RNA科肠病毒属成员，基因组为单链正股RNA(Calnek，B. ff.，Luginbuhl， R. E.，Helmboldt, C. F. ,1997.Avian encephalomyelitis diseases of Poultry. Iowa State University Press，Ames，IA，pp. 571-581) AEV 仅有一个翻译起点，编码产生一个多聚蛋白，多聚蛋白在病毒编码的活性蛋白的作用下，级联水解成功能性蛋白，VPl是病毒的四种结构蛋白中的一种，与病毒的侵入及参与构成病毒的抗原成分有关。新加坡的Li Wei (2008)最近报道用细胞表达的VPl亚单位疫苗能有效地保护鸡免受AEV的感染。他们将AEV的主要抗原蛋白VPl、VP0、VP3分别在细胞SF9中进行表达，然后纯化蛋白，制成亚单位疫苗，并对VPUVPO和VP3生物活性进行了检测，结果发现VP1是主要的抗原蛋白，能有效地保护鸡免受 AEV 的感染(Wei L, Chee LL, Wei T et al. The VPl protein of avian encephalomyelitis virus is a major host-protective immunogen that serves as diagnostic potential. J Virol Methods. 2008Apr ; 149 (I) :56-62.)。完整的病原体含有许多抗原，但并非所有抗原都能刺激宿主产生保护性应答。其中某些抗原还能引起过敏，免疫抑制和其他副作用，这是使用完整的病原体做疫苗的缺陷。 并且目前国内应用的灭活苗生产制备抗原过程繁琐，而弱毒疫苗现也有接种疫苗发病情况存在。而用亚单位疫苗则可以解决这个问题，尤其是这种疫苗除了具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，敏感性高，不产生其他不相关抗体，免疫效果检测方法方便准确外，还十分易于生产。不用动物体或是胚体生产，不会带有组织残留物。而且不需灭活，但安全性高。通过对禽脑脊髓炎病毒VPl cDNA全序列进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在原核细胞中高效表达的cDNA序列，构建了原核表达载体，进行原核表达， 并成功地表达出可溶性的重组蛋白。利用本发明可以生产出禽脑脊髓炎亚单位疫苗，具有商业使用价值
发明内容
本发明的目的是提供一种能表达禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白重组菌的构建，得到的重组菌，以求为大规模工业化生产禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗提供生产用菌株。I.禽脑脊髓炎病毒VPl重组菌的构建本发明设计合成了能生产禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因，这种基因含有如下核苷酸序列(序列I)5'
GAGGACAAGG AGTTGGCGAG TATGGATCTG CAGTACACAT TAAGTCTTTT CGGCATTGTA ACGTTGAACT GGATCCCTTT GGCAATTACA TTTAATGAAG GCAAGACAGT CGATGAAATT
-ATGGGGAAAG AGGATGAAGGI AGGATTTTCCAGTGTGCCTGAAGTGGAGCAACATGTTGTTAACCACAGGGACCTTTGCACGTGACACCTTTTGGCGCTGTTAAAGCCATGGAGGACCCTCGAAAACACCTGGTACATTTCCTGAATTAGCTCCTGGTAAACCTCGACACACAGTAGACCATATAAGTTTATGGGGCGTGCCCATTACTTGTGGGGACATAAATTTACCAAAACTGATATGTCCAGATACCATTGAGTCCCATCAAGGAGGGTTTTGTGACGGGAACGCTTAGGTGGTTTTCCAATTGTATCGTGGTTCTCTCGACATTACCATGACATTCGCAGGAAAGACTAATGTAGATACTTTGTGCCTGAGGGTGTTGCGATAGAGACTGAGAGGAAGGAACAGACCCCTCTGCTCACAAAACATCGGTAGGTGCCATTAGGTTTAATACTGGACAAACTACAAATGTCCAGTTTACTACACGCCACTGGAGCACATCGCAACCCATTCTAAAAACGCGATGGACTCAGTCTTGGGACTCAGATCACCAATTATAGTGCTCAGGATGAGTACCTGCAGGTCACCTACTATATCAGCATTCACAGTTTTCTGTTCCCAGAGCGGTACCAGTGGTTAGCTCATTCACTGACACATCTAGATGAATACATATTGGCTCGATGATGACGAGTTGGTGGAAGGGTCCTCCCATTTTAGTTTGAGGAGGCCCAATGTTAA-3'MetGlyLysGluAspGluGlyGlyPheSerSerValProGluValGlu
GlnHisValValGluAspLysGluProGlnGlyProLeuHisValThr
ProPheGlyAlaValLysAlaMetGlu AspProGlnLeuAlaArg Lys
ThrProGlyThrPheProGluLeuAsp ProGlyLysProArgHisThr
ValAspHisMetAsp Leu Tyr Lys Phe Met Gly Arg Ala His Tys Leu
TrpGlyHisLysPheThrLysThrAspMetGlnTyrThePheGlnHe
ProLeuSerProHeLysGluGlyPheValThrGlyThrLeuArgTrp
PheLeuSerLeuPheGlnLeuTyrArgGlySerLeuAspHeThrMet
ThrPheAlaGlyLysThrAsnValAspGlyHeValTyrPheValPro
GluGlyValAlaHeGluThrGluArgLysGluGlnThrProLeuLeu
ThrLeuAsnTyrLysThrSerValGlyAlaHeArgPheAsnThrGly
GlnThrThrAsnValGlnPheArgHeProPheTyrThrProLeuGlu
HisHeAlaThrHisSerLysAsnAlaMetAspSerValLeuGlyAla
HeThrThrGlnHeThrAsnTyrSerAlaGlnAspGluTyrLeuGln
ValThrTyrTyrHeSerPheAsnGluAspSerGlnPheSerValPro
ArgAlaValProValValSerSerPheThrAspThrSerSerLyrThr
ValMetAsnThrTyrTrpLeuAspAspAspGluLeuValGluGlySer
SerHisPheSerPheAspGluHeGluGluAlaGlnCys
为扩增如上所述的基因，本发明设计并合成了如下相应引物 primer 1:5' -GGGGAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGAGGA-3,(序列 3)
primer 2:5' -GGGGTCGACTTAACATTGGGCCTCCTCAATTTC-3'(序列 4)将含有如上所述核苷酸序列的基因(禽脑脊髓炎VPl蛋白基因)连入克隆载体 PM-18T，并转入大肠埃希氏菌DH5 α。将鉴定正确的阳性质粒pMD18_T_VPl，用ECORI和Sal I 双酶切后，经I. 2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VPl基因。回收的VPl基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VPl蛋白基因的表达质粒pET-32a-VPl，转化表达型大肠埃希氏菌Rossetta， 获得可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌。表达载体pET_32a(+)带有高效表达的T7启动子，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制，能在乳糖的作用下，由宿主菌提供的T7RNA聚合酶进行诱导。构建的禽脑脊髓炎VPl蛋白表达质粒pET-32a_VPl，转化表达型大肠埃希氏菌(Escherichia coli) Rossetta(购自博迈德公司)后构建成重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)Rossetta/ pET-32a-VPl (该菌株已于2011年12月13日送北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为；CGMCC No. 5581)加入
0.2mmol/L乳糖溶液的诱导剂，使禽脑脊髓炎VPl蛋白获得高效表达。2.表达产物的制备(I)发酵及诱导表达将本发明中重组大肠埃希氏菌(Escherichia coii)Rossetta/pET-32a_VPl接种于含有氨苄青霉素和氯霉素的LB平板上，37°C培养过夜。挑取菌落，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液和大肠埃希氏菌培养基(配方为胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠I % )中培养至菌液0D600为0. 6 0. 8时，加入终浓度为0. 02M的乳糖，25 37°C进行诱导培养5 7h,然后4°C, 5000rpm离心5min,收集菌体。用PBS重悬浮菌体。(2)表达产物的鉴定将PBS重悬浮的菌体用超声波裂解后，12000r/min离心15min，取上清加入蛋白电泳上样缓冲液(购自北京博迈德科技发展有限公司)，沸水煮8min后，用12%的分离胶进行SDS-PAGE鉴定(图5中，从左到右分别是蛋白marker，对照，全菌-1，全菌_2)。采用硫酸铵沉淀(每IOOml上清加5. 6g硫酸铵，4°C过夜,然后10000r/min离心IOmin,收集沉淀， 用IOmlPBS (pH7. 2)进行悬浮)、Ni_NTA对上清液进行纯化(见附注I)。将用Ni-NTA纯化的产物进行SDS-PAGE分析(图6，从左到右分别是洗脱液洗脱下的第一管、第二管和第三管)。(3)重组蛋白的抗原活性检测(参考图7)将上述Ni-NTA亲和层析纯化得到的蛋白上清加入到等量的弗氏佐剂(购于sigma 公司)中制备亚单位疫苗。取I. 5mL对2月龄的试验兔多点皮下注射免疫，在首免后28d， 56d分别用弗氏不完全佐剂(购于sigma公司)和纯化蛋白制成的油乳剂疫苗加强免疫，第三次免疫7d后收集血清，用琼脂扩散实验检测抗血清的活性。(图7中，1、7为纯化的VPl 蛋白；2、4、6为免疫后的兔血清；3、5为表达菌株Rossetta破碎后的上清-阴性对照)(4)表达蛋白的纯化过程将收集的菌体用生理盐水进行悬浮，置超声波破碎菌体。加固体硫酸铵至浓度达到10%，充分溶解后4°C存放过夜。离心收集沉淀。用生理盐水重溶沉淀，并用透析袋(北京瑞达恒辉科技发展有限公司生产，截留量14KD)进行透析。用 AGP法(张淑霞，杨增岐.禽脑脊髓炎琼扩抗原的研制和应用.动物医学进展，2001，22 (2) 59-60)测定回收物抗原滴度。
3.本发明所涉及重组菌表达产物制备的疫苗与其他疫苗的比较见表I。表I本发明所涉及的疫苗与现在使用的疫苗比较
权利要求
1.一种表达禽脑脊髓炎VPl蛋白重组菌的构建，其特征在于该重组菌是将含有所禽脑脊髓炎VPl蛋白基因(序列I)连入克隆载体PM-18T，并转入大肠埃希氏菌DH5a ;将鉴定正确的阳性质粒，PMD18-T-VP1用ECORI和SalI双酶切后，经I. 2%琼脂糖凝胶电泳，回收到VPl基因；回收的VPl基因连入pET-32a，构建成禽脑脊髓炎VPl蛋白基因的表达载体 pET-32a_VPl，转化表达型大肠杆菌Rossetta，获得可表达禽脑脊髓炎VPl蛋白的基因工程大肠埃希氏菌pET-32a-VPl/Rossetta株，该菌株已于2011年12月13日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5581。
2.一种由权利要求I构建成的表达禽脑脊髓炎VPl蛋白重组菌重组菌所制备的禽脑脊髓炎病毒VPl蛋白亚单位疫苗，其特征在于该亚单位疫苗含有大肠埃希氏菌CGMCC No. 5581表达的脑脊髓炎VPl蛋白和常规矿物油佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种表达禽脑脊髓炎病毒VP1蛋白重组菌的构建。本发明通过合成了禽脑脊髓炎VP1基因的引物，构建了带有该基因的高效表达载体的重组菌，实现了禽脑脊髓炎VP1蛋白在大肠杆菌中的高效表达，可溶性蛋白表达量约占菌体总蛋白的60％。该表达产物为胞液中可溶性蛋白，具有天然VP1蛋白的抗原活性，用其制备成的禽脑脊髓炎VP1亚单位疫苗能有效地保护禽类免遭禽脑脊髓炎病毒的攻击。这将为工业化生产禽脑脊髓炎亚单位灭活疫苗奠定了坚实的基础。
文档编号A61P31/14GK102586166SQ20121004649
公开日2012年7月18日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者刘新文, 左青山, 胡潇, 范根成, 郭伟伟 申请人:青岛易邦生物工程有限公司