专利名称：一种抗肿瘤控释纳米复合物及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤控释纳米复合物。本发明还涉及上述抗肿瘤控释纳米复合物的制备方法。
背景技术：
阿霉素(doxorubicin，DOX)是一种周期非特异性抗肿瘤抗生素，具有很强的抗 癌活性，抗瘤谱较广。但由于其毒副作用使其在临床上的应用受到限制。苯丙氨酸(Phe) _赖氨酸(Lys)为组织蛋白酶B (cathepsin B)的特异性底物。 cathepsin B可在肿瘤中过度表达。当该底物与阿霉素相连时，药物释放主要发生在肿瘤 部位。然而，由于底物链太短，当与体积较大的阿霉素相连时，酶对底物的作用会因空 间位阻而减弱。在底物与阿霉素之间引入一条自降解链(PABOH)，就会减小酶作用的空 间位阻，实现药物可控制释放。因此，酶自降解链，即酶底物-自降解链-阿霉素的结 合，既可以保持药物在肿瘤的定点释放，又可实现药物的可控制释放。但是，该化合物 一般易溶于有机溶剂，水溶性差，不利于生物应用。纳米钻石可以大大改善难溶性药物的水溶性。另外，其表面活性中心多， 吸附能力强，易于进行表面修饰，物理性质稳定，生物相容性好，无毒，易于进行药 物转运。将纳米钻石与酶自降解链(Phe-Lys-PABC-DOX)通过物理吸附进行结合， 简便易行，不造成环境污染，易于工业化。实现了 Phe-Lys-PABC-DOX的体外生 物应用，实现了阿霉素的可控制药物释放，减小了阿霉素的毒性。纳米钻石在吸附 Phe-Lys-PABC-DOX的同时，吸附上穿膜肽TAT，增强其穿越肿瘤细胞膜的能力，增加 了细胞内的复合物浓度，大大提高药物疗效，且穿膜肽TAT的结合还可增加对耐药性肿 瘤细胞的杀伤作用。纳米钻石同时结合Phe-Lys-PABC-DOX与穿膜肽TAT，克服了抗肿瘤药物阿霉
素毒副作用严重的缺点，既使载体复合物选择性地聚集于肿瘤部位，又增加其穿越肿瘤 细胞膜的能力，减弱了阿霉素的毒性，增强了药物在肿瘤部位的杀伤作用，为实现体内 药物转运提供了理论基础。

发明内容
本发明的目的在于抗肿瘤控释纳米复合物。本发明的又一目的在于提供制备上述抗肿瘤控释纳米复合物的方法。为实现上述目的，本发明提供的抗肿瘤药物控释纳米复合物，以羧基化处理的 纳米钻石为载体，物理吸附酶自降解链和穿膜肽；通过下述方法得到将羧基化处理的纳米钻石分散于二甲基亚砜(DMSO)水溶液中，加入连有酶自 降解链的抗肿瘤药物，室温下搅拌得到复合物；将得到的复合物分散于水中，加入穿膜 肽，室温下搅拌干燥后得到抗肿瘤控释纳米复合物；抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或甲氨蝶呤。
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所述的抗肿瘤控释纳米复合物，其中羧基化处理的纳米钻石是经过强酸羧基化 处理的纳米钻石。所述的抗肿瘤控释纳米复合物，其中酶自降解链依次由苯丙氨酸、赖氨酸、对 氨基苄醇、对硝基苯基氯甲酸酯、抗肿瘤药物共价结合而成。所述的抗肿瘤控释纳米复合物，其中穿膜肽为增强抗肿瘤活性的多肽酪氨 酸_甘氨酸_精氨酸_赖氨酸_赖氨酸_精氨酸_精氨酸_谷胺酰胺_精氨酸_精氨酸_精 氨酸、精氨酸_谷氨酰胺_异亮氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_色氨酸_苯丙氨酸_谷氨酰 胺_天冬酰胺_精氨酸_精氨酸_甲硫氨酸_赖氨酸_色氨酸_赖氨酸_赖氨酸、天冬氨 酸-丙氨酸-丙氨酸_苏氨酸_丙氨酸_精氨酸_甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_精氨酸-丝氨 酸_丙氨酸_丙氨酸_丝氨酸_精氨酸_脯氨酸_苏氨酸_谷氨酸_精氨酸_丙氨酸_脯氨 酸_丙氨酸_精氨酸_丝氨酸_丙氨酸_丝氨酸_精氨酸_脯氨酸_精氨酸_精氨酸_脯 氨酸_缬氨酸_天冬氨酸、精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸 或甘氨酸_色氨酸_苏氨酸_亮氨酸_天冬氨酸_色氨酸_丙氨酸_甘氨酸_酪氨酸_亮 氨酸_亮氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_天冬氨酸_亮氨酸_赖氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙 氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_赖氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_亮氨酸或缬氨酸_苏氨 酸_缬氨酸_亮氨酸_丙氨酸_亮氨酸_甘氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_甘氨酸_缬 氨酸_甘氨酸_缬氨酸_甘氨酸。本发明提供的制备上述抗肿瘤控释纳米复合物的方法，主要步骤为1)羧基化处理纳米钻石；2)将羧基化的纳米钻石加入到二甲基亚砜水溶液中，室温超声分散；3)在分散好的纳米钻石溶液中加入连有酶自降解链的抗肿瘤药物，室温下搅 拌，使酶自降解链结合在纳米钻石上，离心得到沉淀物；抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或甲氨蝶呤；4)将步骤的沉淀物分散制成水溶液，加入穿膜肽的水溶液，室温下搅拌，离心 得到沉淀物，干燥后制备得到目标产物。所述的方法，其中步骤1中羧基化处理纳米钻石是采用强酸羧基化处理，强酸 羧基化处理过程为将纳米钻石加到混合的强酸中搅拌，再分别进行碱洗和酸洗；混合 的强酸为 H2S04-HN03、H2SO4-HF 或 HF-HNO3 ；体积比为 9-1 1。所述的方法，其中步骤2中二甲基亚砜的浓度按体积计为40-60%。所述的方法，其中步骤3中阿霉素的酶自降解链依次由苯丙氨酸、赖氨酸、对 氨基苄醇、对硝基苯基氯甲酸酯、阿霉素共价结合而成。所述的方法，其中穿膜肽为增强抗肿瘤活性的多肽酪氨酸_甘氨酸-精氨 酸_赖氨酸_赖氨酸_精氨酸_精氨酸_谷胺酰胺_精氨酸_精氨酸_精氨酸、精氨酸_谷 氨酰胺_异亮氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_色氨酸_苯丙氨酸_谷氨酰胺_天冬酰胺_精氨 酸_精氨酸_甲硫氨酸_赖氨酸_色氨酸_赖氨酸_赖氨酸、天冬氨酸_丙氨酸_丙氨 酸_苏氨酸_丙氨酸_精氨酸_甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_精氨酸_丝氨酸_丙氨酸_丙氨 酸_丝氨酸_精氨酸_脯氨酸_苏氨酸_谷氨酸_精氨酸_丙氨酸_脯氨酸_丙氨酸_精氨 酸_丝氨酸_丙氨酸_丝氨酸_精氨酸_脯氨酸_精氨酸_精氨酸_脯氨酸_缬氨酸_天 冬氨酸、精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸或甘氨酸_色氨酸-苏氨酸-亮氨酸_天冬氨酸-色氨酸-丙氨酸_甘氨酸_酪氨酸_亮氨酸-亮氨酸-赖 氨酸_异亮氨酸_天冬氨酸_亮氨酸_赖氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_丙氨酸_亮 氨酸_丙氨酸_赖氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_亮氨酸或缬氨酸_苏氨酸_缬氨酸_亮氨 酸_丙氨酸_亮氨酸_甘氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_甘氨酸_缬氨酸_甘氨酸_缬 氨酸-甘氨酸。本发明分别将纳米钻石与酶自降解链、抗肿瘤药物及穿膜肽TAT物理吸附结 合，使药物释放主要发生在肿瘤部位，同时控制药物的释放过程。本发明的抗肿瘤药物 控释纳米复合物增加了对肿瘤细胞的抑制作用。


图1是本发明阿霉素控释纳米复合物的结构示意图。图2为本发明纳米钻石结合酶自降解链反应前后的上清液紫外吸收趋势图；其 中a为纯酶自降解链的上清液紫外吸收趋势图，b为酶自降解链结合在纳米钻石上的上清 液紫外吸收趋势图后，c为酶自降解链结合在纳米钻石上后，用50% DMSO第一次洗过 之后的上清液紫外吸收。图3为本发明阿霉素控释纳米复合物的透射电子显微镜图；图中a为公知产品纳 米钻石(ND) ； b 为 TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX。图4是本发明载体、中间产物和最终产物的红外图(FITR)；其中a是公知产品ND; b是ND经过强酸羧基化处理的产物ND-COOH ；c 是本发明中间产物 ND-Phe-Lys-PABC-DOX ；d 是本发明中 Phe-Lys-PABC-DOX ；e 是本发明终产物 TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX ；f是公知产品穿膜肽TAT。图5是本发明阿霉素控释纳米复合物的Zeta电势图；图中a为公知产品纳米钻石(ND) ； b为羧基化处理的ND，c为 ND-Phe-Lys-PABC-DOX, d 为 TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX。图6是本发明阿霉素控释纳米复合物的细胞毒性结果图中a为公知产品纳米钻石(ND) ； b为羧基化处理的ND，c为 ND-Phe-Lys-PABC-DOX, d 为 TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX。图7是本发明阿霉素控释纳米复合物的对肿瘤细胞迁移能力的影响结果；a为对 照，b 为 DOX 组，c 为 ND-Phe-Lys-PABC-DOX 组，d 为 TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX组。
具体实施例方式本发明提供了一种可控制药物释放，抗肿瘤活性更高的纳米复合物，以改善抗 肿瘤药物目前应用的局限性。以下举阿霉素为例进行说明。本发明提供的抗肿瘤控释纳米复合物，以直径< IOnm的纳米钻石为载体，物理 吸附 Phe-Lys-PABC-DOX 与穿膜肽 TAT。
本发明提供的制备上述抗肿瘤药物控释纳米复合物，其主要步骤为将纳 米钻石经过强酸羧基化处理，超声分散于50%DMSO/H2O，加入连有酶自降解链的 阿霉素(也可以是紫杉醇或甲氨蝶呤等)，室温下磁力搅拌。将得到的复合物分散 于三蒸水中，加入穿膜肽TAT，室温下磁力搅拌，干燥，得到阿霉素控释纳米复合物 (TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX)。本发明制备上述阿霉素控释纳米复合物的方法中，纳米钻石经强酸羧基化的处 理过程为将纳米钻石加入到H2SO4-HClO4(3 1)强酸混合溶液中，40°C搅拌24h，于 0.IM NaOH水溶液中90°C回流，再在0.IM HCl水溶液中90°C回流。本发明提供的制备上述阿霉素控释纳米复合物的方法中，纳米钻石与 Phe-Lys-PABC-DOX在物理吸附过程中的主要特征为a)吸附等温线符合Freundlich方程，吸附剂表面吸附热不一致分布。b)吸附过程符合Lagergren —级动力学方程。C)吸附过程中的自由能为负，吸附可自发进行；焓为负，吸附反应为放热反 应；熵为负，吸附过程无序。d)吸附量受温度、pH值及离子强度的影响。下面再举具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例11)羧基化纳米钻石的制备将0.5g纳米钻石加入到20mL H2SO4-HClO4 (3 1)混合溶液中，40°C搅拌24h， 离心，于O.lMNaOH水溶液中90°C回流2h，离心处理，再在0.1MHC1水溶液中90°C回 流2h，离心，三蒸水多次洗涤，真空干燥。2) ND-Phe-Lys-PABC-DOX 纳米复合物的制备将4mg羧基化的纳米钻石加入到50%二甲基亚砜的水溶液中，室温超声4h使 其分散。在分散好的纳米钻石溶液中加入0.4mgPhe-Lys-PABC-DOX，室温下磁力搅拌 24h，使Phe-Lys-PABC-DOX完全结合在纳米钻石上，离心，弃上清，三蒸水洗。3) TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX 纳米复合物的制备将ND-Phe-Lys-PABC-DOX纳米复合物超声分散后，制成lmg/mL的水溶液，
加入TAT的水溶液，室温下磁力搅拌24h，离心，弃上清，三蒸水洗，真空干燥。图1是本发明实施例1制备的阿霉素控释纳米复合物结构示意图，图中> -NH2 为 Phe-Lys-PAB ODOX ；-NH2 为 Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg。通过图2可以看出本发明中说明Phe-Lys-PABC-DOX与纳米钻石的结合稳定 性。该图是本发明合成反应前后的上清液紫外吸收趋势图。图中a为纯酶自降解链的上 清液紫外吸收趋势图，b为酶自降解链结合在纳米钻石上的上清液紫外吸收趋势图后，c 为酶自降解链结合在纳米钻石上后，用50% DMSO第一次洗过之后的上清液紫外吸收。 说明反应后上清液中Phe-Lys-PABC-DOX减少，即结合在纳米钻石上。洗过之后上清中 基本没有紫外吸收，说明Phe-Lys-PABC-DOX与纳米钻石的结合是稳定的。图3为本发明阿霉素控释纳米复合物的透射电子显微镜图；图中a为公知产品纳 米钻石(ND) ； b为TAT-ND-Phe-Lys-PABC-DOX。从图3中可以看出修饰前的纳米钻
权利要求
1.一种抗肿瘤控释纳米复合物，以羧基化处理的纳米钻石为载体，物理吸附酶自降 解链和穿膜肽；通过下述方法得到将羧基化处理的纳米钻石分散于二甲基亚砜水溶液中，加入连有酶自降解链的抗肿 瘤药物，室温下搅拌得到复合物；抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或甲氨蝶呤；将得到的复合物分散于水中，加入穿膜肽，室温下搅拌干燥后得到抗肿瘤控释纳米 复合物。
2.如权利要求1所述的抗肿瘤控释纳米复合物，其中，所述羧基化处理的纳米钻石是 经过强酸羧基化处理的纳米钻石。
3.如权利要求1所述的抗肿瘤控释纳米复合物，其中，酶自降解链依次由苯丙氨酸、 赖氨酸、对氨基苄醇、对硝基苯基氯甲酸酯、抗肿瘤药物共价结合而成。
4.如权利要求1所述的抗肿瘤控释纳米复合物，其中，穿膜肽为酪氨酸-甘氨酸-精 氨酸_赖氨酸_赖氨酸_精氨酸_精氨酸_谷胺酰胺_精氨酸_精氨酸_精氨酸、精氨 酸_谷氨酰胺_异亮氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_色氨酸_苯丙氨酸_谷氨酰胺_天冬酰 胺_精氨酸_精氨酸_甲硫氨酸_赖氨酸_色氨酸_赖氨酸_赖氨酸、天冬氨酸_丙氨 酸-丙氨酸-苏氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-丝氨酸-丙 氨酸-丙氨酸-丝氨酸-精氨酸-脯氨酸-苏氨酸-谷氨酸-精氨酸-丙氨酸-脯氨 酸_丙氨酸_精氨酸_丝氨酸_丙氨酸_丝氨酸_精氨酸_脯氨酸_精氨酸_精氨酸_脯 氨酸_缬氨酸_天冬氨酸、精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸 或甘氨酸_色氨酸_苏氨酸_亮氨酸_天冬氨酸_色氨酸_丙氨酸_甘氨酸_酪氨酸_亮 氨酸_亮氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_天冬氨酸_亮氨酸_赖氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙 氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_赖氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_亮氨酸或缬氨酸_苏氨 酸_缬氨酸_亮氨酸_丙氨酸_亮氨酸_甘氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_甘氨酸_缬 氨酸_甘氨酸_缬氨酸_甘氨酸。
5.一种制备权利要求1所述抗肿瘤控释纳米复合物的方法，主要步骤为1)羧基化处理纳米钻石；2)将羧基化的纳米钻石加入到二甲基亚砜水溶液中，室温超声分散；3)在分散好的纳米钻石溶液中加入连有酶自降解链的抗肿瘤药物，室温下搅拌，使 酶自降解链结合在纳米钻石上，离心得到沉淀物；抗肿瘤药物为阿霉素、紫杉醇或甲氨 蝶呤；4)将步骤的沉淀物分散制成水溶液，加入穿膜肽的水溶液，室温下搅拌，离心得到 沉淀物，干燥后制备得到目标产物。
6.如权利要求5所述的方法，其中，步骤1中羧基化处理纳米钻石是采用强酸羧基化 处理，强酸羧基化处理过程为将纳米钻石加到混合的强酸中搅拌，再分别进行碱洗和 酸洗；混合的强酸为H2SO4-HNOp H2SO4-HF或HF-HNO3 ；体积比为9-1 1。
7.如权利要求5所述的方法，其中，步骤2中二甲基亚砜的浓度按体积计为 40-60%。
8.如权利要求5所述的方法，其中，步骤3中阿霉素的酶自降解链依次由苯丙氨酸、 赖氨酸、对氨基苄醇、对硝基苯基氯甲酸酯、阿霉素共价结合而成。
9.如权利要求5所述的方法，其中，穿膜肽为酪氨酸-甘氨酸-精氨酸-赖氨酸-赖 氨酸_精氨酸_精氨酸_谷胺酰胺_精氨酸_精氨酸_精氨酸、精氨酸_谷氨酰胺_异亮氨 酸_赖氨酸_异亮氨酸_色氨酸_苯丙氨酸_谷氨酰胺_天冬酰胺_精氨酸_精氨酸_甲 硫氨酸_赖氨酸_色氨酸_赖氨酸_赖氨酸、天冬氨酸_丙氨酸_丙氨酸_苏氨酸_丙氨 酸-精氨酸-甘氨酸_精氨酸_甘氨酸_精氨酸_丝氨酸_丙氨酸_丙氨酸-丝氨酸-精 氨酸_脯氨酸_苏氨酸_谷氨酸_精氨酸_丙氨酸_脯氨酸_丙氨酸_精氨酸_丝氨酸_丙 氨酸_丝氨酸_精氨酸_脯氨酸_精氨酸_精氨酸_脯氨酸_缬氨酸_天冬氨酸、精氨 酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸_精氨酸或甘氨酸_色氨酸_苏氨酸_亮 氨酸_天冬氨酸_色氨酸_丙氨酸_甘氨酸_酪氨酸_亮氨酸_亮氨酸_赖氨酸_异亮氨 酸_天冬氨酸_亮氨酸_赖氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_赖 氨酸_赖氨酸_异亮氨酸_亮氨酸或缬氨酸_苏氨酸_缬氨酸_亮氨酸_丙氨酸_亮氨 酸_甘氨酸_丙氨酸_亮氨酸_丙氨酸_甘氨酸_缬氨酸_甘氨酸_缬氨酸_甘氨酸。
全文摘要
一种抗肿瘤控释纳米复合物及制备方法，以羧基化处理的纳米钻石为载体，吸附酶自降解链和穿膜肽而组成。制备方法为将纳米钻石经过强酸羧基化处理，分散于二甲基亚砜水溶液中，加入连有酶自降解链的抗肿瘤药物，室温下搅拌得到复合物；将得到的复合物分散于水中，加入穿膜肽，室温下搅拌干燥后得到抗肿瘤控释纳米复合物。本发明所述的纳米载体复合物制备简便，无毒无污染，易于工业化。体外研究表明，该复合物既可以实现抗肿瘤药物的可控制释放，又可以增强药物对肿瘤的杀伤作用，为药物转运提供了新的材料和方法。
文档编号A61K47/48GK102008733SQ20101056444
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者叶玲, 戚颖哲, 王迎, 邵建群, 黄珊珊 申请人:首都医科大学