专利名称：一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法，具体涉及提高原核表达猪IFN-α及IFN-γ抗病毒活性的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
我国是一个养猪大国，猪的各类疾病，尤其是病毒性疾病严重危害了养猪业的发展。为此，研制出高效低成本的抗病毒和免疫增强药物是非常重要的应对措施。干扰素是动物机体在诱导因子的作用下分泌的具有免疫调节功能、广谱抗病毒、抗肿瘤等多种生物活性的分泌性蛋白质，是机体防御系统的重要组成部分，其抗病毒、抗肿瘤和抗寄生虫的效果已被广泛研究并得到肯定。猪干扰素(Interferon，IFN)具有广谱的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节作用，成为抗病毒制剂研究的重点。已知猪干扰素有α、β和Y三种，干扰素α属于I型，具有广谱的抗病毒作用，干扰素Y属于II型，除具有抗病毒作用外，还具有较强的免疫调节功能。近年来，猪的干扰素受到广泛重视，出现了许多具有抗病毒活性的基因工程重组猪IFN-α和IFN-Y。但在实际应用中，往往只是单个应用某一型干扰素。而在机体内，I 型的α-干扰素主要表现为抑制病毒复制作用，而II型的Y-干扰素主要的免疫调节活性远远高于α和β干扰素，I型和II型协同作用，具有较大的免疫预防和治疗功能。因此， 在实际应用中，如果模拟天然状态，将两种类型的干扰素进行联合抗病毒应用，将为临床应用提供更加有效抗病毒干扰素应用方法，更好地发挥其抗病毒作用。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，利用ΡΕΤ-30原核表达载体，构建了猪 IFN-α及IFN-γ基因的原核重组表达质粒；将具有免疫原性的两种重组蛋白猪IFN-α及猪IFN-Y按一定比例作为抗病毒制剂，对猪干扰素在Η(15细胞上抑制星状病毒复制的活性进行检测，并确定了最佳抗病毒比例。为实现上述目地，本发明采用以下技术方案本发明涉及一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法，包括提取猪白细胞 DNA和猪脾脏RNA，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌，诱导表达猪IFN- α和IFN- γ。具体包括如下步骤1.构建猪IFN-α及IFN-γ基因的原核重组表达质粒提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA，特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-Y基因，将 IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体ρΕΤ_30构建重组表达质粒pET-30_IFN-α和 pET-30-IFN- γ，转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达猪IFN- α及IFN- γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。2.重组质粒的诱导表达将酶切鉴定正确及测序结果正确的重组表达质粒菌液取100 μ 1加入到5ml卡那霉素抗性LB培养液中摇菌过夜，之后按1 100的比例接入200ml含卡那霉素的LB培养液中37°C、250r/min扩大培养2.证，加入IPTG (终浓度为lmmol/L)诱导表达，分别在诱导后0、2、4、5、6、8、10小时取Iml菌液12000rpm离心2min，弃上清，干燥后悬于100 μ 1 2X 上样缓冲液中，100°C煮沸5分钟后进行SDS-PAGE。3.包涵体的提取和重组蛋白的纯化将IL菌液加入IPTG诱导表达5h后，于4°C以5000g离心15min，吸弃上清，按 1 20 (w/v)用菌体裂解液重悬菌体沉淀，超声破碎后，4°C、12000g离心20min，收集沉淀。 按1 20(W/V)依次用包涵体洗涤液洗涤包涵体；8000g离心20min，沉淀为包涵体。按 1 20 (W/V)的比例用7M盐酸胍变性液溶解包涵体，16000g离心15min，收集上清。采用含低浓度盐酸胍的谷胱甘肽复性液对变性蛋白进行稀释复性，即在磁力搅拌下，将变性蛋白以20μ l/20sec的速度稀释于14倍体积的复性液中，置于4°C 12h ；4°C、12000g离心15min， 收集上清；将Ni2+亲和树脂层析柱先用0.02mol/L PBS (pH 7. 8)缓冲液平衡，再用变性缓冲液平衡；将制备好的复性蛋白过M2+亲和树脂层析柱，然后用平衡液和洗涤液依次清洗柱，最后依次用10mmOl/L、50mmOl/L、100mmOl/L、150mmOl/L的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白。 缓冲液按照分子克隆实验指南中的方法进行配制。纯化产物进行12% SDS-PAGE，测定纯化效率。4.重组蛋白含量和病毒毒价(TCID50)测定用紫外分光光度计分别测定纯化后的猪IFN- α和IFN- γ在波长260和280处的 OD值，按照公式计算纯化后的样品的蛋白质质量浓度；计算公式为蛋白质质量浓度(mg/ mL) = 1. 45X0D280-0. 74X0D260 ；在96孔细胞培养板上用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养H(15细胞长成单层，吸弃培养液，分别接种用PBS(0. OlM pH 7. 4) 10倍递次稀释的星状病毒，每个稀释度重复8孔，同时以PBS(0.01M pH 7.4)做阴性对照，37°C，5%的C02培养Ih后，分别加入 0. Iml含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养，逐日观察细胞病变(CPE)，连续3d，然后按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。5.单一重组蛋白抗病毒活性检测将纯化并已测定浓度的猪IFN- α和IFN- γ分别10倍稀释，再分别进行2倍递次稀释，按0. Iml/孔的量加入两块Η(15细胞长成单层的96孔细胞培养板上，37°C，5%的C02 诱导培养24h后，吸弃培养液，分别用100 TCID50的星状病毒攻毒，同时设干扰素不加病毒的对照和病毒不加干扰素的对照，继续培养并观察CPE，连续3d，参照病毒毒价测定法，按 Reed-Muench法分别计算猪IFN- α和IFN- γ在Η(15细胞上抑制星状病毒复制的活性。6.重组蛋白的联合抗病毒活性检测将纯化的猪IFN-α和IFN-γ蛋白分别稀释为已确定的该重组蛋白抑制星状病毒复制的最佳浓度；将稀释好的猪IFN-α和IFN-γ蛋白按照不同比例1 1，5 1,52 1， 53 1,54 1,55 1,56 1配比混勻，接种Η(15细胞长成单层的96孔细胞培养板上， 每个配比度重复12孔，37°C，5%的C02诱导培养Mh ；吸弃培养液，分别用100 TCID50的星状病毒攻毒，同时设干扰素不加病毒的对照和病毒不加干扰素的对照，37°C，5%的C02继续培养。逐日观察CPE，连续3d，参照病毒毒价测定法，按Reed-Muench法计算猪IFN- α和IFN-Y在不同比例时抑制生长在H(15细胞上的星状病毒复制的活性；重组猪IFN-α蛋白和IFN-γ蛋白在53 1的比例时，抑制星状病毒复制的活性最好。本发明还涉及一种根据上述方法制备得到的猪IFN-α和IFN-γ，当IFN-α和 IFN-Y的质量比为53 1时抗星状病毒的活性最佳。本发明方法的优点在于1、成功构建重组表达质粒pET-30-IFN- α和pET-30-IFN- γ2、确定了猪IFN- α和IFN- γ在Η(15细胞上抑制星状病毒复制的活性。3、计算猪IFN- α和IFN- γ在不同比例时抑制生长在Η(15细胞上的星状病毒复制的活性，并确定了达到最佳抑制病毒效果时两种干扰素的比例。


图 1 为 IFN- α 和 IFN- γ 的 PCR 扩增结果；M 为 DL2000Marker ；1 为 IFN- α 扩增结果；2为IFN-γ扩增结果。图2为重组质粒双酶切鉴定结果；Ml为DL2000Marker ； 1为pET-30-IFN- α双酶切结果；2、3为pET-30-IFN- Y双酶切结果；4为ρΕΤ_30空质粒双酶切结果；Μ2为 DL15000Markero图3为重组质粒的诱导表达；M为蛋白Marker ； 1-7为pET-30-IFN-y/BL21的 SDS-PAGE 结果；a-g 为 pET-30-IFN- α /BL21 的 SDS-PAGE 结果；8、h 为 pET30a/BL21 用 IPTG 诱导IOh的表达结果。图 4 为重组目的蛋白 pET-30-IFN- α /BL21 和 pET_30_IFN_ y /BL21 纯化后的 SDS-PAGE ；M为预染蛋白Marker ； 1-4为pET-30-IFN- y /BL21纯化过程中连续的收集目的蛋白；6-9为pET-30-IFN- α /BL21纯化过程中连续的收集目的蛋白。
具体实施例方式实施例1 1.构建猪IFN-α及IFN-γ基因的原核重组表达质粒提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA，特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因，结果如图1所示。将IFN-α和IFN-Y基因分别插入原核表达载体ρΕΤ_30，构建重组表达质粒 pET-30-IFN- α和pET-30_IFN-γ，转化大肠杆菌BL21，在IPTG诱导下表达猪IFN-α及 IFN- γ，SDS-PAGE分析重组表达蛋白。结果如图2所示。2.重组质粒的诱导表达将测序结果正确的重组表达质粒菌液取100 μ 1加入到5ml卡那霉素抗性LB培养液中摇菌过夜，之后按1 100的比例接入200ml含卡那霉素的LB培养液中37°C、250r/min 扩大培养2. 5h，加入IPTG (终浓度为lmmol/L)诱导表达，分别在诱导后0、2、4、5、6、8、10小时取11111菌液12000印111离心&1^1，弃上清，干燥后悬于10(^1 2X上样缓冲液中，100°C煮沸5分钟后进行SDS-PAGE，结果如图3所示。在各时间的表达重组质粒pET-30-IFN- α经诱导后在21. 3kD处出现明显条带，重组质粒pET-30-IFN- γ经诱导后在19. 4kD处出现明显条带，与预测的结果一致。3.包涵体的提取和重组蛋白的纯化将IL菌液加入IPTG诱导表达5h后，于4°C以5000g离心15min，吸弃上清，按1 20(w/v用菌体裂解液重悬菌体沉淀，超声破碎后，4°C、12000g离心20min，收集沉淀。 按1 20 (W/V)依次用包涵体洗涤液洗涤包涵体。8000g离心20min，沉淀为包涵体。按 1 20 (W/V的比例用7M盐酸胍变性液溶解包涵体，16000g离心15min，收集上清。采用含低浓度盐酸胍的谷胱甘肽复性液对变性蛋白进行稀释复性，即在磁力搅拌下，将变性蛋白以 20μ l/20sec的速度稀释于14倍体积的复性液中，置于4°C 12h。4°C、12000g离心15min， 收集上清。将Ni2+亲和树脂层析柱先用0. 02mol/L PBS (pH 7. 8)缓冲液平衡，再用变性缓冲液平衡。将制备好的复性蛋白过M2+亲和树脂层析柱，然后用平衡液和洗涤液依次清洗柱，最后依次用10mmOl/L、50mmOl/L、100mmOl/L、150mmOl/L的咪唑洗脱液洗脱目的蛋白。 缓冲液按照分子克隆实验指南中的方法进行配制。纯化产物进行12% SDS-PAGE，电泳结果见图4。4.重组蛋白含量和病毒毒价(TCID50)测定用紫外分光光度计分别测定纯化后的猪IFN- α和IFN- γ在波长260和280处的 OD值，按照公式计算纯化后的样品的蛋白质质量浓度。计算公式为蛋白质质量浓度(mg/ mL) = 1. 45X0D280-0. 74 XO拟60。计算结果如表1所示。表1 重组蛋白的含量计算结果Table 1 Content of the Purified protein pET-30-IFN-α /BL21and pET-30 -IFN-y/BL2权利要求
1.一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法，其特征在于包括提取猪白细胞DNA 和猪脾脏RNA，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌，诱导表达猪IFN- α和IFN- γ。
2.一种根据权利要求1所述的方法制备得到的猪IFN-α和IFN-Y，其特征在于所述猪IFN-α和IFN-γ的质量比为53 1时抗星状病毒的活性最佳。
全文摘要
本发明公开了一种提高原核表达猪干扰素抗病毒活性的方法，包括提取猪白细胞DNA和猪脾脏RNA，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌，诱导表达猪IFN-α和IFN-γ；重组猪IFN-α和IFN-γ在质量比为53∶1时，抑制星状病毒复制的活性最好；本发明方案提供了一种表达量高、纯度的好猪干扰素生产制备方法及提高干扰素抗病毒活性使用方法，为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及用于猪的传染性疾病的预防和治疗奠定了基础。
文档编号A61P31/14GK102329813SQ20111023788
公开日2012年1月25日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者俞向前, 叶承荣, 朱建国, 林 源, 赵伟鸽 申请人:上海交通大学, 上海市浦东新区动物疫病预防控制中心