专利名称：环维黄杨星d的提纯方法
技术领域：
本发明涉及环维黄杨星D的提纯和质量控制方法，以及含有经纯化的环维黄杨星D的药物组合物。
背景技术：
环维黄杨星D(Cyclovirobuxine D)系从黄杨科植物小叶黄杨及其同属植物中提取的生物碱有效单体，商品名为“黄杨宁”，其片剂收载于2000年版中国药典，临床上主要用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常、心肌缺血、改善微循环障碍等(梁涛等，解放军药学学报，2001，17(1)35-38；沈祥春等，中药药理与临床，2000，16(4)15-16)。
药理实验及临床研究表明，环维黄杨星D的安全范围较窄(Liu XJ等，ActaPharmcol Sin，1981，2(2)101-107)，且是脂溶性生物碱，水溶性差，目前仅有黄杨宁片剂上市，不能满足临床对多种剂型的用药要求，同时环维黄杨星D的稳定性及生物利用度也尚需提高。因此，人们对环维黄杨星D进行广泛而深入的研究，例如通过结构修饰或制剂手段等，以期获得活性更高、能满足临床对多种剂型的要求。这些技术例如，结构修饰技术(药学学报，2004，39(6)434-438)，进一步纯化技术(CN1064869A、CN1438236A)；成盐技术(CN1456568A、CN1435429A、CN1456165A、CN1379040A)；改善其溶解和释放性能的技术，例如分散片、速释分散体、口腔崩解片、滴丸(尹丽等，中国新药杂志，2002，11(12)939-942、CN1461751A、CN1394607A、CN1438011A)；缓、控释制剂(CN1460478A、CN1435178A)等。
然而，采用传统分离纯化方法，即萃取、重结晶方法而得到的环维黄杨星D中，还含有与其结构极为相似的环常绿黄杨碱C、环原黄杨碱C和环原黄杨碱A等不想要的生物碱成分。非常不利的是，这些不想要的生物碱的极性与环维黄杨星D极为接近，很难采用常规手段将它们彻底分离掉。人们对现有分离纯化技术作了进一步的改进，但是仍不能有效地除去上述“其它生物碱”。例如，CN1379040A涉及环维黄杨星D的精制工艺，然而经薄层色谱方法检识，发现除环维黄杨星D斑点外，仍含有至少2个杂质斑点；这表明该方法也只是简单地除去了按CN1033456C方法得到的产品中的少量杂质，并不能够达到除去除其他生物碱的目的。
徐新军等(中国药科大学学报，2002，33(5)408-411)提及采用柱层析可以获得环维黄杨星D对照品，但并没有教导具体方法。本领域技术人员获得该文献的启发后，最直接做法就是采用高效液相制备柱获得纯度更高的环维黄杨星D。例如，CN1438236A即涉及以高效液相制备柱来纯化环维黄杨星D的方法(声称含量在90％以上，但是并没有提供含量测定方法)。遗憾的是，这种HPLC制备柱价格昂贵，上样量小(例如小于1g)、重复使用率低、产率低(例如CN1438236A方法的产率约为15％)，不利于环维黄杨星D的工业化生产。
环维黄杨星D结构不含双键，在紫外及可见区均无吸收，直接采用高效液相色谱方法中的紫外检测有一定困难，因此现有技术一直停留在各种衍生化HPLC水平上(例如紫外、荧光方法)。另外，采用高效液相色谱蒸发光散射检测器(ELSD)检测时，峰形差且难将杂质与环维黄杨星D分离。最近，张正行等(中药新药与临床药理，2004，15(2)110-112)采用以末端波长为检测波长的HPLC测定环维黄杨星D含量，实现了一定的突破。该文献中采用氨基色谱柱为固定相，以磷酸缓冲盐为流动相，210nm为紫外检测波长。但是，耐用性较差，经数次使用后色谱柱中的键合相流失严重，柱效下降快，而在以缓冲盐为流动相时情况尤为严重。
因此，迫切需要能工业化实施的环维黄杨星D提纯方法和质量控制方法。

发明内容
本发明建立了不同于高效液相制备柱的方法，即采用适宜填料的柱层析法来实现纯化环维黄杨星D的目的，以获得高纯度、高产率、低成本、可工业化大量生产的环维黄杨星D制备方法。
因此，本发明的一个目的是提供提取纯化环维黄杨星D的方法。该方法适宜于工业化大生产，其优点在于操作简便、成本低、纯度高、产率高，尤其是产率很高，例如环维黄杨星D含量大于90％的产品得率大于50％，优选大于60％，更优选大于70％(重量百分比)。
下面对发明提取纯化方法作进一步说明a)选择柱层析的各项条件层析柱径高比的要求合适的层析柱内径层析柱高度多为1∶5-100，常选1∶10-50，更常选1∶10-20。
层析柱内的填料包括硅胶、氧化铝、ODS、聚酰胺、凝胶、大孔吸附树脂、离子交换树脂、硅藻土、纤维素等，优选硅胶、ODS、氧化铝、大孔吸附树脂、离子交换树脂，更优选采用硅胶、氧化铝。
填料的用量填料与待纯化原料的重量比例，视原料杂质的多少、填料分离度的优劣和目标纯度的高低的不同而不同，一般可为10-2000∶1，常选20-500∶1，更常选50-200∶1。
填料的粒度可为10-500目，优选100-300目，更优选200-300目。
填料装柱方法分为湿法和干法两种装柱方法，优选湿法装柱。
上样方法分为湿法和干法两种上样方法，视原料和填料的性质而定，我们选择干法上样。
洗脱方法分为自上而下洗脱或自下而上洗脱，优选自上而下洗脱。
洗脱溶剂主要为有机溶剂，包括C1-C15醇、氯仿、石油醚、丙酮、正己烷、苯、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、呋喃、四氢呋喃、吡啶或它们不同比例的混合体系；优选为甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、异戊醇、氯仿、乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯或它们不同比例的混合体系；更优选采用石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇或它们的混合体系。另外，可在洗脱剂中加入少量碱性溶剂(例如氨水、二乙胺、三乙胺等)来改善分离度。
洗脱速度流速通常控制在0.01-10L/Kg.h，优选0.05-5L/Kg.h，更优选0.1-2L/Kg.h。(L/Kg.h指每公斤填料每小时流过的溶剂体积为1升)b)纯化步骤待分离的样品为含环维黄杨星D的黄杨宁粗品，按中国药典2000年版一部第153页的含量测定方法(测定总生物碱方法)，含量在大于30％的粗品均可以为本发明的起始原料。所述方法包括以下步骤1)选择层析柱和填料；2)根据不同的填料，筛选与之相适宜的溶剂系统；3)按照不同的柱层析方法，将填料采用湿法或干法装柱；4)将起始原料用适量的适宜溶剂溶解后，拌入适量填料混匀，蒸干，研细搅匀上样；5)选用溶剂系统的不同比例，以一定的流速进行梯度或等度洗脱，分段收集洗脱液，经浓缩，干燥，即可得高纯度的环维黄杨星D。
与现有技术相比，本发明方法具有以下优点1)成本低。不需要特殊的仪器设备，对洗脱剂的级别无过高要求，而制备柱为了防止污染或堵塞，常常需要预柱除杂质或选择一些高纯度的价格很贵的色谱级别的洗脱液，一旦制备柱失效，其内部的填料和外部的不锈钢材料则不能再使用，并且还需配备价格昂贵的制备液相，成本远高于本方法。
2)收率高。例如环维黄杨星D含量大于90％的产品得率大于50％，优选大于60％，更优选大于70％，显著高于现有技术。
3)纯度高。本发明方法纯化后的环维黄杨星D的纯度大于90％，优选为大于95％，更优选为大于98％，最高可以获得纯度大于99％(例如99.5％)的样品。在此所指的纯度是按本发明检测方法测定的。
4)操作简便。柱层析的洗脱、收集、浓缩、干燥等各项操作均比较简单，没有繁琐的操作和特殊的操作。
5)工艺很稳定。本工艺平行操作得到的结果在误差范围内相平行，具有良好的重现性，能够实现工业化大生产。
本发明方法，适于有效分离按2000年版中国药典方法测得环维黄杨星D含量30％-90％的黄杨宁粗品。
另一方面，本发明提供了环维黄杨星D含量的检测方法a)UV-高效液相色谱法以C18、C8、氰基、苯基以及阳离子树脂柱为固定相，紫外检测器，测定环维黄杨星D的含量，检测波长190-215nm；流动相甲醇、乙腈、四氢呋喃、正丁醇、钾盐和钠盐的缓冲盐、离子对试剂、酸碱调节剂(控制流动相酸碱度在2.0-9.0)。
b)ELSD-高效液相色谱以蒸发光散射检测器(ELSD)测定环维黄杨星D的含量。固定相C18、C8、氰基、氨基以及阳离子树脂柱；流动相甲醇、乙腈、四氢呋喃、正丁醇、酸碱调节剂(控制流动相酸碱度在2.0-9.0)上述两种方法的专属性均良好，ELSD方法的灵敏度要高于紫外检测。以本发明UV-高效液相色谱法为例，与2000年版中国药典中的测定方法做了对比，结果表明该法的专属性显著高于药典方法。
在另一方面，本发明提供含有高纯度环维黄杨星D的药物组合物，其中包括环维黄杨星D和适量药用赋形剂，其中每个制剂规格含环维黄杨星D为0.01-50mg、优选0.1-20mg、和更优选0.2-10mg(按测定方法实施例1测得)；所述环维黄杨星D的纯度大于80％、优选大于88％、和更优选大于92％。
本发明药物组合物为口服或非肠道给药剂型，可采用本领域技术人员已知的制剂技术制得。
所述口服剂型包括但不限于常规、速释、缓/控口服制剂，如片剂、分散片、软/硬胶囊剂、速释分散体、口腔崩解片、滴丸、缓释片、控释胶囊或纳米制剂(例如粒径为0.1-300nm，95％粒子小于100nm)，适宜的示例药用赋形剂包括但不限于填充剂(稀释剂)如(预压性)淀粉，糊精，糖粉，乳糖，甘露醇，纤维素类，各种钠、钙盐，各种植物油、动物油和矿物油，聚乙二醇等；崩解剂，如(交联)PVP，羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素等；润滑剂和助流剂，如硬脂酸镁，二氧化硅(微粉硅胶)，滑石粉等。
所述非肠道给药剂型例如包括注射液、冻干粉针和输液剂，适宜的示例药用赋形剂包括等渗调节剂，如氯化钠、葡萄糖、木糖醇、山梨醇；酸碱调节剂，包括有机酸、无机酸、氨基酸；支持剂，如甘露醇，山梨醇，木糖醇，氯化钠，葡萄糖，乳糖，海藻糖，右旋糖酐等。
药效学试验文献指出黄杨宁的小鼠的半数致死量LD50为8.9mg/kg；CN02148452.X黄杨宁的小鼠的半数致死量LD50为13.93mg/kg；本发明黄杨宁的小鼠的半数致死量LD50为15.22mg/kg。
CN02148452.X连续3个月给Beagle犬静脉注射黄杨宁的基本安全剂量为1.5mg/kg；本发明连续3个月给Beagle犬静脉注射黄杨宁的基本安全剂量为2.0mg/kg。
研究表明，本发明方法制备的高纯度的环维黄杨星D显示出更好的药效，尤其是毒性方面的表现更理想。
提取纯化实施例1称取1g环维黄杨星D含量50％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量100～200目硅胶，蒸干，研匀；按原料药∶硅胶＝1∶120称取100～200目硅胶，用乙酸乙酯湿法装于一3×60cm的层析柱内(硅胶×h＝3×46.5cm，1BV≈300ml)，再将研匀的样品装于硅胶层析柱上端，用乙酸乙酯∶无水乙醇∶氨水＝120∶2∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱20倍柱体积，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的环维黄杨星样品，产率为55左右％。
提取纯化实施例2称取2g环维黄杨星D含量60％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量100～200目氧化铝，蒸干，研匀；按原料药∶氧化铝＝1∶100称取100～200目氧化铝，用石油醚湿法装于一3×60cm层析柱内(氧化铝×h＝3×32cm，1BV≈200ml)，再将研匀的样品装于氧化铝层析柱上端，用石油醚∶无水乙醇＝70∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱20倍柱体积，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的样品，产率为60％左右。
提取纯化实施例3称取2g环维黄杨星D含量70％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量100～200目氧化铝，蒸干，研匀；按原料药∶氧化铝＝1∶100称取100～200目氧化铝，用石油醚湿法装于一3×60cm层析柱内(氧化铝×h＝3×30.5cm，1BV≈200ml)，再将研匀的样品装于氧化铝层析柱上端，用石油醚∶无水乙醇＝100∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱5倍柱体积后，再用石油醚∶无水乙醇＝50∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱15倍柱体积，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的样品，产率为65％左右。
提取纯化实施例4称取7g环维黄杨星D含量70％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量100～200目氧化铝，蒸干，研匀；按原料药∶氧化铝＝1∶100称取100～200目氧化铝，用石油醚湿法装于一5×75cm层析柱内(氧化铝×h＝5×45cm，1BV≈700ml)，再将研匀的样品装于氧化铝层析柱上端，用石油醚∶无水乙醇＝100∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱5倍柱体积后，用石油醚∶无水乙醇＝50∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱15倍柱体积，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的样品，产率为60％左右。
提取纯化实施例5
称取2g环维黄杨星D含量75％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量100～200目氧化铝，蒸干，研匀；按原料药∶氧化铝＝1∶150称取100～200目氧化铝，用石油醚湿法装于一3×60cm层析柱内(氧化铝×h＝3×40.5cm)，再将研匀的样品装于氧化铝层析柱上端，用石油醚∶无水乙醇＝50∶1的溶剂以0.6L/Kg.h流速洗脱20倍柱体积，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的样品，产率为70％左右。
提取纯化实施例6称取2g环维黄杨星D含量80％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量200～300目氧化铝，蒸干，研匀；按原料药∶氧化铝＝1∶150称取200～300目氧化铝，用石油醚湿法装于一3×60cm层析柱内(氧化铝×h＝3×42.5cm)，再将研匀的样品装于氧化铝层析柱上端，用石油醚∶无水乙醇＝50∶1的溶剂以0.3L/Kg.h流速洗脱15倍柱体积，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的样品，产率为70％左右。
提取纯化实施例7称取1g环维黄杨星D含量85％左右的黄杨宁原料药，用适量溶剂溶解，拌入适量200-400目的ODS，蒸干，研匀；按原料药∶ODS＝1∶50称取200～400目ODS，用5％甲醇水溶液(含0.2％三乙胺)湿法装于一1.5×45cm层析柱内(ODS的×h＝1.5×32.5cm)；将研匀的样品装于层析柱上端，以5％、10％、20％、30％、40％的甲醇水溶液(含0.2％三乙胺)进行梯度洗脱，洗脱速度控制在1.0L/Kg.h左右，分段收集(1倍柱体积每段)，浓缩，干燥，得含量大于90％的样品，产率为50％左右％测定方法实施例1按照提取纯化实施例2方法获得环维黄杨星D，采用具有紫外检测器的高效液相色谱法测定。色谱柱以辛烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱分析柱；210nm为检测波长；流动相磺酸钠盐(用磷酸和三乙胺调节Ph)∶乙腈＝70∶30；流速0.8ml/min。去除空白溶剂，按面积归一化法计算环维黄杨星D的含量为93％。


测定方法实施例2按照提取纯化实施例5方法获得环维黄杨星D，采用具有ELSD检测器的高效液相色谱法测定。色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱分析柱；流动相三乙胺与乙酸的混合液∶乙腈＝60∶40。去除空白溶剂，按面积归一化法计算环维黄杨星D的含量为91％。

测定方法实施例3按照提取纯化实施例4方法获得环维黄杨星D，采用具有紫外检测器的高效液相色谱法测定。色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱分析柱；205nm为检测波长；流动相KH2PO4缓冲盐(用H3PO4调pH)∶乙腈＝80∶20。去除空白溶剂，按面积归一化法计算环维黄杨星D的含量为99％。

制剂实施例1冻干注射剂按照提取纯化实施例2方法获得环维黄杨星D，称取1.2g环维黄杨星D，用适量磷酸使环维黄杨星D溶解。加注射用水至800ml，搅匀，加甘露醇50g，搅拌使其完全溶解，加0.05％(w/v)的药用炭，加热搅拌，并保持30分钟后。粗滤脱炭。滤液加注射用水至1000ml，搅拌均匀，测定pH3-5。药液用微孔滤膜(φ0.22um)精滤，按测定方法实施例1检测药液中环维黄杨星D的含量，合格后，灌封(每支1ml)，冷冻，包装。
制剂实施例2注射液按照提取纯化实施例5方法获得环维黄杨星D，称取1.1g环维黄杨星D，用适量枸橼酸使环维黄杨星D溶解。加注射用水至500ml，搅匀，加0.01％(w/v)的药用炭，加热搅拌并保持30分钟后。粗滤脱炭。滤液加注射用水至1000ml，搅拌均匀，测定pH4-6。精滤，采用测定方法实施例1，按测定方法实施例1检测药液中环维黄杨星D的含量，合格后，灌封(每支2ml)，灭菌，包装。
制剂实施例3葡萄糖输液称取注射用葡萄糖525g，加注射用水2L，溶解，用适量盐酸调节pH为4-5之间，加0.05％(w/v)的药用活性炭，加热60℃，搅拌并保持30分钟，粗滤脱炭，滤液中加入0.35g环维黄杨星D(按照提取纯化实施例6方法获得)，搅匀、待完全溶解后，加0.01％(w/v)的药用炭，加热搅拌并保持30分钟后。粗滤脱炭。滤液补加注射用水至10L，搅拌均匀，测定pH4-5。药液用微孔滤膜(φ0.22um)精滤，按测定方法实施例2检测药液中环维黄杨星D的含量，合格后，灌封(每瓶100ml)，灭菌，包装。
制剂实施例4氯化钠输液称取注射用氯化钠90g，加注射用水2L，溶解，用适量盐酸调节pH为5-6之间，加0.05％(w/v)的药用活性炭，加热60℃，搅拌并保持30分钟，粗滤脱炭，滤液中加入0.35g环维黄杨星D(按照提取纯化实施例6方法获得)，搅匀、待完全溶解后，加0.01％(w/v)的药用炭，加热搅拌并保持30分钟后。粗滤脱炭。滤液补加注射用水至10L，搅拌均匀，测定pH5-6。药液用微孔滤膜(φ0.22um)精滤，按测定方法实施例1检测药液中环维黄杨星D的含量，合格后，灌封(每瓶100ml)，灭菌，包装。
制剂实施例5软胶囊按照提取纯化实施例3方法获得环维黄杨星D，称取1.2g环维黄杨星D，用200g的花生油加热使环维黄杨星D完全溶解，冷至室温后加工成1000粒软胶囊。
制剂实施例6滴丸取2g聚乙二醇6000、16g聚乙二醇4000加热至熔融，混合均匀；称取按照提取纯化实施例3方法获得的环维黄杨星D环维黄杨星D0.12g、甘露醇1g和0.05g盐酸半胱氨酸得混合粉，经微粉化过200目筛后，加入上述基质中，以液体石蜡为冷却剂，滴制法制成1000丸，干燥，即得。
制剂实施例7口崩片按照提取纯化实施例4方法获得环维黄杨星D，称取0.6g环维黄杨星D，经超微粉化使粒径在5μm左右，加入25g甘露醇、25g喷雾干燥乳糖、50g微晶纤维素、30g羧甲基淀粉钠、20g交联聚乙烯吡咯烷酮PVPXL、5g微粉硅胶，混匀，采用干法直接压片，制成1000片，即得。
制剂实施例8缓、控释制剂称取糊精50g，羟丙基甲基纤维素K1530g和按照提取纯化实施例4方法获得的环维黄杨星D 2.2g，混合均匀，用5％的PVP水溶液湿法制粒，干燥，各加入1％二氧化硅和硬脂酸镁，整粒，混合均匀，按测定方法实施例2检验中间体、确定片重制成1000片，压片包装，即得。
权利要求
1.环维黄杨星D的提纯方法，包括以下步骤取黄杨宁粗品，用溶剂溶解后拌入适量填料中，混匀、蒸干、研细搅匀上样；按填料∶黄杨宁粗品＝10-2000∶1(重量比)的比例，称取适量填料，用溶剂湿法或干法装于层析柱内；将研匀的样品装于硅胶层析柱上端，用洗脱溶剂系统进行梯度或等度洗脱，分段收集洗脱液，经浓缩、干燥，即得高纯度的环维黄杨星D，其中层析柱的内径与高度比为1∶5-100，所述填料选自硅胶、氧化铝、ODS、聚酰胺、凝胶、大孔吸附树脂、离子交换树脂、硅藻土、纤维素。
2.如权利要求1的方法，所述层析柱的内径与高度比为1∶10-50，层析柱内的填料选自10-500目的硅胶、ODS、氧化铝、大孔吸附树脂、离子交换树脂。
3.如权利要求1或2的方法，所述层析柱的内径与高度比为1∶10-20，层析柱内的填料选自100-300目的硅胶、氧化铝，和洗脱溶剂选自C1-C15醇、氯仿、石油醚、丙酮、正己烷、苯、甲苯、乙醚、乙酸乙酯、呋喃、四氢呋哺、吡啶或它们不同比例的混合体系。
4.如权利要求3的方法，所述填料与黄杨宁粗品的比例为20-500∶1，和所述洗脱溶剂选自甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇、异戊醇、氯仿、乙醚、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、或它们的混合体系。
5.如权利要求4的方法，所述洗脱溶剂中进一步含有碱性溶剂。
6.如权利要求1-5之一的方法，采用UV-高效液相色谱法或者ELSD-高效液相色谱法测定，提取纯化后环维黄杨星D的纯度为90％～100％。
7.如权利要求--的方法，所述待分离样品是按2000年版中国药典方法测得的环维黄杨星D含量大于30％的黄杨宁粗品。
8.一种药物组合物，含有按照权利要求1-7之一方法纯化的环维黄杨星D和适量药用赋形剂，其中含有0.01-50mg环维黄杨星D，和所述环维黄杨星D的纯度大于80％。
9.如权利要求8的药物组合物，含有0.01-50mg纯度大于88％的环维黄杨星D。
10.如权利要求8的药物组合物，含有0.2-10mg纯度为92-99％的环维黄杨星D。
11.如权利要求8-10之一的药物组合物，为口服或非肠道给药剂型。
全文摘要
本发明涉及环维黄杨星D的提纯和质量控制方法，以及含有经纯化的环维黄杨星D的药物组合物。
文档编号A61P9/00GK1733792SQ200510097980
公开日2006年2月15日 申请日期2005年9月2日 优先权日2005年9月2日
发明者徐新盛, 文艳秋 申请人:徐新盛, 文艳秋