专利名称：含氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶的制备方法及其在制备术后疤痕抑制剂上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶的制备方法及其在制备术后疤痕抑制剂上的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
青光眼是一种能够导致失明的眼科疾病，其临床症状为眼压过高压迫视盘和损伤视神经。目前滤过手术是一种治疗青光眼的常用方法，但术后伤口过度愈合反应形成的瘢痕组织往往导致青光眼滤过手术的失效。术后瘢痕形成的主要原因是术后炎症反应和结膜下组织纤维化。在临床上，为了有效抑制术后炎症反应以及结膜下组织纤维化，术后一到两周内抗增生药物水剂需要多次注射到患者眼内。多次药物注射不仅会给患者带来一定病痛，而且容易引起眼部组织的毒副作用。如多次注射抗增生药物5-氟尿嘧啶水剂往往引起结膜和角膜上皮细胞的毒性反应、伤口组织液渗漏等症状。因此，研究和开发出具有抑制术后炎症反应和组织纤维化作用的新型制剂是眼科学研究者的当务之急。核心蛋白多糖(Decorin)是由一个富含亮氨酸残基的核心蛋白和一条氨基葡萄糖多聚糖链组成。诸多研究表明，在肾、肌肉、肺以及眼睛等器官的手术后使用Decorin可以有效抑制伤口的炎症反应和组织纤维化，其作用的主要机理是抑制瘢痕形成中起着重要作用的转化生长因子P (TGF-P)的活性。TGF-P广泛分布在血小板以及巨噬细胞等表面， 其受体存在于所有细胞上。TGF-P的主要生物学效应是调控细胞增殖和结缔组织合成、刺激间质细胞增生、促进成纤维细胞和平滑肌细胞等合成分泌胶原蛋白及纤维连接蛋白和抑制基质降解酶的产生并促进基质沉积。但核心蛋白多糖人工合成非常困难，而且目前使用的方法多为水剂注射法，造成成本增加。在多肽分子结构中引入氨基葡萄糖单元可以得到与核心蛋白多糖结构类似的糖肽。由于多肽及其衍生物具有良好的自组装性能，通过上述糖肽自组装有望于得到具有抑制伤口组织瘢痕化作用的凝胶态制剂。

发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是提供一种含有氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶的制备方法。其制备方法是(I)利用固相合成技术制备含疏水性端基的三肽，然后纯化；所述三肽结构的氨基酸序列为苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，疏水性端基为N-芴-9-甲氧羰基、萘乙酰基或芘丁酰基；(2)将纯化的三肽与氨基葡萄糖缩合得到糖肽，然后纯化；(3)将糖肽分散在磷酸盐缓冲溶液中，通过加热溶解-冷却法制备糖肽凝胶。上述方案中，固相合成技术所采用的树脂为2-氯-3-苯甲基氯树脂，肽链的延长为碳端到氮端。上述方案中，合成糖肽的缩合剂为N，N_ 二环己基碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺。上述方案中，含疏水性端基的三肽和糖肽可以采用将粗产品用少量良溶剂溶解， 然后在大量不良溶剂中沉淀的方法纯化。所述的良溶剂可为三氟乙酸、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷等。所述的不良溶剂可选择乙醚、石油醚等。上述方案中，磷酸缓冲溶液的pH为7. 4。通过加热溶解-冷却法制备糖肽凝胶时，可以首先升高溶液温度至80度使糖肽完全溶解，随后在室温下缓慢冷却。本发明其次所要解决的技术问题在于提供上述制备的含有氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶制备术后疤痕抑制剂上的应用。多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物，由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。通过分子间氢键作用、疏水性作用和堆积作用等，多肽及其衍生物可以在水溶液自组装形成具有纳米纤维微观结构的水凝胶。由于在制备过程无需加入化学交联剂，高含水量的多肽凝胶可以被直接注射到靶向位点，因此广泛应用于组织工程、药物控释等领域。本发明在多肽分子结构中引入氨基葡萄糖单元，得到与核心蛋白多糖结构类似的糖肽。由于多肽及其衍生物具有良好的自组装性能，上述糖肽自组装得到具有抑制术后组织瘢痕化作用的凝胶态制剂。使用这种新型糖肽凝胶制剂将具有以下两个优点。一、通过注射法很容易将凝胶置于手术位点。二、由于固定在凝胶内部氨基葡萄糖不会在伤口区域扩散，因此应用时只需一次性注射，这就简化治疗过程并能够节约成本。


图I.含氨基葡萄糖单元的糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine结构式。图2. NIH/3T3成纤维细胞在糖肽水凝胶表面培养48小时后细胞形态。图3.只进行滤过手术后兔眼的滤过泡(滤过手术组)和术后注射糖肽凝胶的兔眼滤过泡(凝胶组)生存时间曲线。图4.只进行滤过手术后兔眼(滤过手术组)和术后注射糖肽凝胶的兔眼(凝胶组)眼内压。图5.只进行滤过手术14天后兔眼的组织学切片HE染色图。图6.滤过手术后注射糖肽凝胶7天后兔眼的组织学切片HE染色图。图7.滤过手术后注射糖肽凝胶14天后兔眼的组织学切片HE染色图。图8.滤过手术后注射糖肽凝胶21天后兔眼的组织学切片HE染色图。图9.只进行滤过手术14天后兔眼的组织学切片Masson三色染色图。图10.滤过手术后注射糖肽凝胶7天后兔眼的组织学切片Masson三色染色图。图11.滤过手术后注射糖肽凝胶14天后兔眼的组织学切片Masson三色染色图。图12.滤过手术后注射糖肽凝胶21天后兔眼的组织学切片Masson三色染色图。图13.含氨基葡萄糖单元的糖肽Nap-Phe-Phe-Asp-glucosamine结构式。图14.含氨基葡萄糖单元的糖肽Py-Phe-Phe-Asp-glucosamine结构式。
具体实施例方式实施例I(I)含疏水性N-芴-9-甲氧羰基的三肽FMOC-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH制备以2-氯-三苯甲基氯树脂(树脂上有效氯的取代度为1.32mm0l/g)为固相载体，使用多肽固相自动合成仪制备短肽FMOC-Phe-Phe-Asp (OtBu)-0H。肽链在树脂上从碳端向氮端延长。具体的合成步骤如下称取I. 5g 2-氯-三苯甲基氯树脂(有效氯含量为I. 5 X I. 32 = I. 98mmol)，分别用IOmL 二氯甲烷(CH2Cl2)和N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)洗涤3次，然后用IOmL DMF浸泡树脂30分钟。抽去DMF，加入溶有 FMOC-Asp (OtBu) -OH(3X1. 98mmol)和二异丙基乙胺(DiEA, 4X I. 98mmol)的 DMF 溶液到树脂中，于室温下振荡反应30分钟。抽去反应液，用DMF洗涤树脂3次后加入IOmL体积比为2 8的哌啶和DMF混合液到树脂中，于室温下振荡反应20分钟，脱去FMOC保护基。抽去反应液，用IOmL DMF洗涤树脂3次后加入溶有FMOC-Phe-OH(2X1. 98mmol)、 DiEA(3X1.98mmol)、并三氮唑-N，N，N，N，-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，2. 4X I. 98mmol) 及I-羟基苯并三氮唑(H0Bt，2. 4X1.98mmol)的DMF溶液到树脂中，于室温下振荡反应I. 5 小时。抽走DMF，用IOmL DMF洗涤树脂3次后，重复上述脱保护和缩合的步骤。待肽链合成结束后，分别用IOmL DMF和CH2Cl2洗涤树脂3次，室温下干燥树脂。加入20mL切落剂(体积比为I : 2 7的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2)将产品从树脂上切落，收集滤液并浓缩。加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并多次洗涤，室温下将产品干燥过夜。(2)含氨基葡萄糖单元的糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine合成将上述合成的三妝FMOC-Phe-Phe-Asp (OtBu)-OH(Immol)、N, N' - 二环己基碳酸亚胺(DCC，I. 2mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，I. 2mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中， 于冰浴下搅拌反应4小时。抽滤除去沉淀，加入4mL溶有氨基葡萄糖盐酸盐(3mmol)和 NaHC03(6mmol)的水溶液到滤液中，于室温下搅拌反应24小时。浓缩除去溶剂，加入15mL 体积比为3 7的三氟乙酸和CH2Cl2-合溶液，室温下搅拌反应I小时。加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并用乙醚多次洗涤，室温下将产品干燥过夜。用高效液相色谱(HPLC)纯化糖肽(HPLC分离柱为C18柱，用含0. Iwt%氨水的乙腈和含0. Iwt%氨水的去离子水做梯度淋洗，紫外检测波长为254nm)，结构式见附图I。(3)糖肽凝胶的制备将糖肽分散在磷酸缓冲溶液(PBS)中，加热至80°C让其溶解形成澄清溶液(浓度为9mg/mL)。缓慢降低溶液温度至室温时，糖肽可以自组装形成稳定的超分子水凝胶。(4)糖肽凝胶的生物安全性评价将上述糖肽凝胶转移至24孔细胞培养板中用紫外光照射除菌。将含有NIH/3T3 成纤维细胞的DMEM培养液加入到糖肽凝胶的表面。待细胞在培养箱培养一段时间后，分别加入溴乙啡锭二聚体(EthD-I)和钙黄绿素(calcein AM)到糖肽凝胶表面进行细胞死活染色。在培养箱中培养一段时间后，用激光共聚焦显微镜观测凝胶表面的细胞形态。检测结果表明绝大部分NIH/3T3成纤维细胞可以粘附在糖肽凝胶表面，细胞存活率约为87%，具体的细胞形态见附图2。(5)兔眼滤过手术滤过手术前首先对糖肽凝胶做消毒处理。具体方法如下使用滤膜将糖肽溶液过滤除菌，然后再将凝胶置于紫外光下照射除菌。滤过手术在兔子的右眼进行，左眼作为参照。在滤过手术中，向深层肌肉注射氯胺酮和甲苯噻嗪对兔子做全身麻醉，使用地卡因对兔子右眼做局部麻醉。12只成年白兔平均分为两组第一组兔眼只进行滤过手术，第二组兔眼在滤过手术中注射糖肽凝胶。具体的滤过手术操作如下在共轴照明立体显微镜下，用眼睑扩张器暴露眼球，做以角膜缘为基底的结膜瓣，分离结膜下组织并暴露巩膜。结膜瓣下做厚为1/2、大小为4X4mm的巩膜瓣，其基底至透明角膜内1_。随后，在巩膜瓣下沿角膜缘切穿至前房， 切除1X3_大小的角巩膜组织。做虹膜周切后，用10-0型尼龙线缝合巩膜瓣两角至巩膜床。随后缝合结膜瓣，在缝合最后一针前，将糖肽凝胶注射到第二组兔眼的结膜下。最后在两组兔眼上均匀涂抹四环素眼膏。(6)临床观察用裂隙灯显微镜观察兔眼术后滤过泡形态及生存时间，使用生存分析软件分析滤过泡的生存时间。用Log-rank检验分析两组兔眼中滤过泡的生存时间差异，并对结果作 Kaplan-Meier生存曲线。使用Tono-pen型眼压计测量兔眼眼压，测量时使用地卡因对兔子右眼做局部麻醉。对手术眼和对照眼的实验结果进行统计学分析，Student’ s T检验用于分析眼压结果，P < 0. 05有统计学意义。兔眼术后滤过泡生存时间以及眼内压结果分别见附图3和4。临床观察结果表明相对于只进行滤过手术组，术后注射糖肽凝胶可以显著延长滤过泡的生存时间(可以延迟至术后21天，附图3)和降低兔眼眼内(术后21天内均保持在较低水平，附图4)。(7)组织学分析在滤过手术后的7 21天内，向心脏注射致死剂量的戊巴比妥处死手术兔。摘除眼球并保存在多聚甲醛溶液中进行组织固定。随后用石蜡包埋眼组织，做成4 u m的病理切片，切片包含结膜、周边房角及手术滤过泡区域等眼组织结构。将切片染色进行组织学分析，同时将切片Masson三色染色用于观察组织胶原的分布沉积情况。HE染色和Masson 三色染色切片结果分别见附图5-8和9-12。组织学分析结果表明滤过手术后注射糖肽凝胶可以显著抑制结膜下组织成纤维细胞增生和降低伤口组织的胶原蛋白沉积，滤过泡在术后21天内依然清晰可见，而只进行滤过手术组的兔眼滤过泡则由于成纤维细胞大量增生而关闭，说明滤过手术后注射糖肽凝胶可以显著抑制伤口组织瘢痕的形成。实施例2(I)含疏水性萘乙酰基的三肽Nap-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH制备参照实例I的方法在2-氯-三苯甲基氯树脂上延长肽链，待肽链合成结束后，加入溶有萘乙酸(2X1.98mmol)、DiEA (3 X I. 98mmol)、HBTU (2. 4X1. 98mmol)和 HOBt (2. 4X1. 98mmol)的DMF溶液到树脂中，室温下振荡反应I. 5小时。抽走DMF，分别用 IOmL DMF和CH2Cl2洗涤树脂3次，室温下干燥树脂。加入20mL切落剂(体积比为I : 2 : 7 的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2)将产品从树脂上切落，收集滤液并浓缩。加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并多次洗涤，室温下将产品干燥过夜。(2)含氨基葡萄糖单元的糖肽Nap-Phe-Phe-Asp-glucosamine合成将上述合成的三妝Nap-Phe-Phe-Asp (OtBu)-OH(Immol)、DCC (I. 2mmol)和 NHS (I. 2mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，于冰浴下搅拌反应4小时。抽滤除去沉淀，加入4mL溶有氨基葡萄糖盐酸盐(3mmol)和NaHC03 (6mmol)的水溶液到滤液中，于室温下搅拌反应24小时。浓缩除去溶剂，加入15mL体积比为3 7的三氟乙酸和CH2Cl2混合溶液，室温下搅拌反应I小时。加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并用乙醚多次洗涤，室温下将产品干燥过夜。用高效液相色谱(HPLC)纯化糖肽(HPLC分离柱为C18柱，用含0. 1%氨水的乙腈和含0. I %氨水的去离子水做梯度淋洗，紫外检测波长为254nm)，结构式见附图13。(3)糖肽凝胶的制备将糖肽分散在磷酸缓冲溶液(PBS)中，加热至80°C让其溶解形成澄清溶液(浓度为10mg/mL)。缓慢降低溶液温度至室温时，糖肽可以自组装形成稳定的超分子水凝胶。与实例I中糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，实例2中的糖肽 Nap-Phe-Phe-Asp-glucosamine只是其一端疏水性基团改变。因此类似与实例I中的糖肽水凝胶，上述实例2中制备的自组装糖肽水凝胶理论上也具有抑制术后伤口组织瘢痕形成的作用。实施例3(I)含疏水性芘丁酰基的三肽Py-Phe-Phe-Asp (OtBu) -OH制备参照实例I的方法在2-氯-三苯甲基氯树脂上延长肽链，待肽链合成结束后，加入溶有芘丁酸(2X1.98mmol)、DiEA (3 X I. 98mmol)、HBTU(2. 4X I. 98mmol)和 HOBt (2. 4X1. 98mmol)的DMF溶液到树脂中，室温下振荡反应I. 5小时。抽走DMF，分别用 IOmL DMF和CH2Cl2洗涤树脂3次，室温下干燥树脂。加入20mL切落剂(体积比为I : 2 : 7 的醋酸、三氟乙醇和CH2Cl2)将产品从树脂上切落，收集滤液并浓缩。加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并多次洗涤，室温下将产品干燥过夜。(2)含氨基葡萄糖单元的糖肽Py-Phe-Phe-Asp-glucosamine合成将上述合成的三妝Py-Phe-Phe-Asp-glucosamine (Immol)、DCC (I. 2mmol)和 NHS (I. 2mmol)溶于20mL无水四氢呋喃中，于冰浴下搅拌反应4小时。抽滤除去沉淀，加入 4mL溶有氨基葡萄糖盐酸盐(3mmol)和NaHC03 (6mmol)的水溶液到滤液中，于室温下搅拌反应24小时。浓缩除去溶剂，加入15mL体积比为3 7的三氟乙酸和CH2Cl2混合溶液，室温下搅拌反应I小时。加入大量冷乙醚沉淀出产品，过滤并用乙醚多次洗涤，室温下将产品干燥过夜。用高效液相色谱(HPLC)纯化糖肽(HPLC分离柱为C18柱，用含0. I %氨水的乙腈和含0. I %氨水的去离子水做梯度淋洗，紫外检测波长为254nm)，结构式见附图14。(3)糖肽凝胶的制备将糖肽分散在磷酸缓冲溶液(PBS)中，加热至80°C让其溶解形成澄清溶液(浓度为6mg/mL)。缓慢降低溶液温度至室温时，糖肽可以自组装形成稳定的超分子水凝胶。与实例I中糖肽FMOC-Phe-Phe-Asp-glucosamine相比，实例3中的糖肽 Py-Phe-Phe-Asp- glucosamine只是其一端疏水性基团改变。因此类似与实例I中的糖肽水凝胶，上述实例3中制备的自组装糖肽水凝胶理论上也具有抑制术后伤口组织瘢痕形成的作用。
权利要求
1.一种含有氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶的制备方法，其特征是，包括如下步骤1)利用固相合成技术制备含疏水性端基的三肽，然后纯化；所述三肽结构的氨基酸序列为苯丙氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸，疏水性端基为N-芴-9-甲氧羰基、萘乙酰基或芘丁酰基；2)将纯化的三肽与氨基葡萄糖缩合得到糖肽，然后纯化；3)将糖肽分散在磷酸盐缓冲溶液中，通过加热溶解-冷却法制备糖肽凝胶。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于，固相合成技术所采用的树脂为 2-氯-3-苯甲基氯树脂，肽链的延长为碳端到氮端。
3.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于，合成糖肽的缩合剂为N，N-二环己基碳二亚胺或N-羟基琥珀酰亚胺。
4.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于，含疏水性端基的三肽和糖肽采用将粗产品用少量良溶剂溶解，然后在大量不良溶剂中沉淀的方法纯化。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的良溶剂为三氟乙酸、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺或二氯甲烷；所述的不良溶剂为乙醚或石油醚。
6.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸缓冲溶液的pH为7. 4。
7.根据权利要求I或2所述的制备方法，其特征在于，通过加热溶解-冷却法制备糖肽凝胶时，首先升高溶液温度至80度使糖肽完全溶解，随后在室温下冷却。
8.根据权利要求I 7所述方法制备的含有氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶在制备术后疤痕抑制剂上的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，涉及一种含有氨基葡萄糖单元的糖肽水凝胶的制备方法。它是通过含有氨基葡萄糖单元的糖肽在生理条件下自组装形成的水凝胶。由于其结构中氨基葡萄糖单元可以抑制术后疤痕形成的作用，该糖肽水凝胶有望用做抑制术后疤痕形成的凝胶态制剂。使用这种新型糖肽凝胶制剂将具有以下两个优点。一、通过注射法很容易将凝胶置于手术位点。二、由于固定在凝胶内部氨基葡萄糖不会在伤口区域扩散，因此应用时只需一次性注射，这就简化治疗过程并能够节约成本。
文档编号A61K9/06GK102600067SQ20121010265
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月10日 优先权日2012年4月10日
发明者冯俊, 卓仁禧, 姜发纲, 张先正, 梁亮, 许小丁 申请人:武汉大学