专利名称：脐带华通胶间充质干细胞在制备细胞移植材料中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物材料在制备医用材料中的用途，特别涉及以人脐带华通胶为原料制备的间充质干细胞在制备细胞移植材料以及组织工程种子细胞材料方面的应用。按本发明方法制备的医用材料，包括细胞移植材料和种子细胞材料，可以用于对椎间盘退变性疾病的治疗。
背景技术：
椎间盘退变性疾病(degenerative disc disease, DDD)是一种常见病、多发病， 所引起的下腰痛常严重影响患者的工作及生活。椎间盘由纤维环包绕凝胶状的髓核组织及上下的软骨终板组成，其凝胶状的髓核组织含有大量蛋白多糖及II型胶原，蛋白多糖可吸收水分增强张力，以对抗上下椎体的压力。椎间盘退变时髓核内细胞数量减少，增殖能力降低，合成蛋白多糖及II型胶原等细胞外基质的能力下降，使髓核含水量低，影响了椎间盘的生物力学性能。目前对椎间盘退变的治疗方法包括保守治疗和手术治疗。使用较多的髓核摘除术和脊柱融合术，能暂时缓解临床症状，但远期疗效不理想，且有一定并发症。近年来，建立在组织工程技术和细胞移植技术的治疗策略，利用种子细胞、支架材料及参入各种细胞因子以修复退变椎间盘，展现了良好的前景。无论是组织工程技术还是细胞移植技术的应用，自体髓核细胞被认为是最理想的种子细胞，但髓核中细胞含量少，髓核细胞体外增殖能力差，其来源受到很大限制，不能满足治疗需要；而且，从相邻椎间盘获取自体髓核细胞会引起相应椎间盘的退变。因此，寻找一种扩增能力强，易于获取的适用种子细胞是成为当前应用细胞移植技术治疗椎间盘退变的关键问题。由于间充质干细胞具有无限增殖能力及多能分化潜能，被认为是当前最有前景的种子细胞来源。已有学者利用骨髓间充质干细胞诱导分化成为髓核细胞，能够分泌蛋白多糖及II型胶原等功能蛋白。但成人骨髓中还存在着造血细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等多种细胞成分，间充质干细胞含量相对稀少，约为 1/105，分离纯化相当困难。而且，骨髓中间充质干细胞的数量及增殖分化能力随着年龄增长迅速递减。其他来源的间充质干细胞如脂肪、肾脏、肺及胎儿脐血等间充质干细胞，或者含量稀少难以制备，或需创伤性手术才能获得，因此限制了它们的临床应用。本专利申请所称“脐带华通胶间充质干细胞”，或称“来源于脐带华通胶的间充质干细胞”，英文名称为“Umbilical Cord Wharton's Jelly-Derived MSCs，UW-MSCs”，是指以脐带华通胶为原材料经扩增技术传代培养的细胞群。胎儿娩出母体后，胎盘连同脐带的生理功能终结，继胎儿之后被母体排出体外，成为人体排泄物。剖腹产是对胎儿生产过程的人工干预，在以手术方法从母腹中取出胎儿后，同时将胎盘连同脐带作为遗弃物从母腹中取出。近年来，医学界发现，存在于脐带华通胶的间充质干细胞有许多潜在的利用价值。包括本申请人的在先专利申请“200910157731. 6脐带华通胶间充质干细胞的制备方法及其产品”在内的若干文献，公开了将华通胶间充质干细胞在体外诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、 软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞及神经细胞的技术，但尚无人报告华通胶间充质干细胞具有向髓核细胞分化的潜能。

发明内容
本发明要解决的技术问题是，将脐带华通胶间充质干细胞应用于制备细胞移植材料或组织工程种子细胞材料，所制备的细胞移植材料或组织工程种子细胞材料可用于人椎间盘退行性病变的治疗。本发明脐带华通胶间充质干细胞在制备细胞移植材料和组织工程种子细胞材料中的应用，其方法包括以下工艺步骤以新生儿脐带为材料制备华通胶间充质干细胞；分离培养正常髓核细胞。以实施椎间盘摘除术被摘除遗弃的椎间盘标本为材料分离制备髓核细胞；应用非接触式或接触式细胞共培养方法以髓核细胞诱导分化脐带华通胶间充质干细胞成为髓核细胞。本发明应用脐带华通胶间充质干细胞为原材料制备用于人椎间盘退行性病变治疗的细胞移植材料或组织工程种子细胞材料，其中的髓核细胞性能接近于自体髓核细胞， 是一种比较理想的同种异体移植医用生物材料，显示了诸多优点人脐带华通胶来源的间充质干细胞可活跃增殖进行自我更新并具有多向分化潜能，相对于骨髓间充质干细胞，来源丰富，易于提取；细胞具有端粒酶活性，增殖能力强；不表达HLA-DR，低表达HLA-ABC，其免疫源性更低；其来源为脐带，是婴儿分娩后的遗弃物，避免了伦理道德问题。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1分离培养华通胶间充质干细胞取新鲜新生儿脐带约30cm为材料，无菌储存于D-Hanks液中，2_6°C保存。所取脐带材料以足月产健康新生儿脐带为优，可保证其脐带发育良好；再则，优选剖腹产新生儿脐带，较之阴道产感染率低。在超净工作台中用平衡盐溶液洗去脐带残留血液，将脐带剪成4cm大小节段，对每一节段均纵行剪开脐带外膜，游离去除2条脐动脉和1条脐静脉，取血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，剪切成约Imm3大小碎块，以平衡盐溶液冲洗后，浸于浓度为0. 2% 胶原酶溶液中，胶原酶溶液，置37°C消化5小时，观察消化情况，未见组织块，消化液成粘稠状，2500rpm离心10分钟，弃掉上层上清液，剩余粘稠液体再用0. 25%胰蛋白酶37°C恒温消化30分钟，2500rpm离心10分钟，弃上清液，加DMEM/F12培养基和胎牛血清，使胎牛血清浓度达到20%，于37°C、5%二氧化碳条件培养。细胞于第2天开始贴壁，第4天用含20% 胎牛血清的DMEM/F12完全培养基进行换液。以后每2 3天换液一次，待细胞融合达到 80-90%时，进行传代培养。弃上清液，PBS洗细胞，0.25%胰蛋白酶消化5分钟，IOOOrpm离心，进行细胞传代。传代后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养，每3天进行换液。细胞免疫表型鉴定，表达⑶73，⑶90，⑶105，⑶四，⑶166，HLA-ABC,不表达⑶；34，⑶45， HLA-DR0实施例2分离培养正常髓核细胞椎间盘摘除术是长久以来对椎间盘突出症患者普遍实施的一种手术治疗方法，手术过程是将移位的椎间盘摘除或部分切除。本发明是收集新鲜的经手术摘除的椎间盘标本，立即在超净工作台中分离出髓核组织，PBS清洗两遍，除去残留的血液。将髓核组织剪碎约1. Omm3大小，放入5ml离心管中，加入用DMEM/F12无血清培养基配制好的0. 2% II型胶原酶溶液，置37°C消化5小时，通过无菌不锈钢丝网OOOmm)过滤组织碎片。细胞悬液 1000r/min离心5分钟，弃上清液，收集细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，于 37°C、5%二氧化碳条件培养。细胞于第2天开始贴壁，以后每2 3天换液一次，待细胞融合达到80-90%时，进行传代培养。传代后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行培养， 每3天进行换液。实施例3非接触式细胞共培养方法诱导分化脐带华通胶间充质干细胞用带有插入层的Transwell六孔板进行非接触式共培养，其插入层具有高密度孔径，孔径大小为0. 4 μ m，细胞因子能够穿过，其材料为聚对苯二甲酸乙酯，细胞能够粘附生长，插入层接种髓核细胞，六孔板下层接种华通胶间充质干细胞，细胞最优接种数量为，华通胶间充质干细胞2 X 104，髓核细胞为6X 104。培养7天后，收集华通胶间充质干细胞。实施例4接触式细胞共培养方法诱导分化脐带华通胶间充质干细胞(1)利用活细胞染料羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(5， 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidy ester, CFSE)标记华通胶间充质干细胞。 胰蛋白酶消化收集第三代细胞，PBS洗两遍，计数细胞，用无血清DMEM/F12培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为1. O X 106/ml，加入一定量10 μ mol/L浓度的CFSE溶液，使其终浓度为 5. 0mol/L，37°C孵育30分钟，加入一定量胎牛血清使其终浓度为40%，终止反应10分钟， IOOOrpm离心5分钟，PBS洗两遍，用于细胞共培养。(2)用普通六孔板进行接触式共培养。细胞接种密度为6. OX 107cm2。用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养基，37°C、5%二氧化碳培养箱中培养，隔2 3天换液。细胞最优接种数量为，华通胶间充质干细胞1. 5X104,髓核细胞4. 5X 104。细胞培养7天，每2 3天换液。(3)共培养7天后对接触式共培养的细胞利用MoFlo高速流式细胞分选仪进行细胞分选。胰蛋白酶消化细胞，IOOOrpm离心5分钟，PBS洗两遍，用250 μ IPBS悬浮细胞，通过直径30 μ m的无菌滤网，除去细胞团块，进行高速流式细胞分选。激发波长为490 μ m，发射波长为530 μ m。荧光阳性细胞为华通胶间充质干细胞，荧光阴性细胞为髓核细胞。细胞收集于含PBS液的离心管中。在实际应用时，可任意选择使用实施例3所述的非接触式细胞共培养方法或者实施例4所述的接触式细胞共培养方法。发明人根据实时定量PCR(ReaI-TimePCR)分析共培养后华通胶间充质干细胞基因表达变化，结果表明接触式共培养或非接触式共培养后，华通胶间充质干细胞表达髓核细胞标志基因(S0X-9、II型胶原和蛋白多糖)显著上调；ELISA 方法分析共培养后的华通胶间充质干细胞合成及分泌蛋白多糖和二型胶原的能力显著提高，证明华通胶间充质干细胞被诱导分化为髓核细胞。其作为一种医用生物材料，可以按细胞移植方法治疗椎间盘退行性变；也可作为组织工程种子细胞，复合组织工程支架，构建组织工程椎间盘，用于治疗椎间盘退变性疾病。下述发明人所做的动物实验，证明了本发明技术的实用性。实验例华通胶间充质干细胞细胞移植治疗椎间盘退变动物实验
家犬在CT引导下穿刺椎间盘纤维环，进行椎间盘退变动物模型制作。术后6周 MRI显示穿刺造模椎间盘发生退变，Pfirrmarm分级退变达到4级。家犬在麻醉下进行经接触式共培养诱导分化的华通胶间充质干细胞移植，将1 X IO6细胞经注射器移植入退变椎间盘间隙，空白对照组注射aiilPBS溶液。2月后进行影像学观察，实验组椎间盘经细胞移植治疗后，椎间盘退变由PfirrmanM级改善为3级，椎间盘高度增高；对照组椎间盘退变变为5 级，椎间盘间隙变窄。处死动物后，进行免疫组织化学分析表明，实验组椎间盘髓核内蛋白多糖和二型胶原含量比对照组显著增高。
权利要求
1.脐带华通胶间充质干细胞在制备人椎间盘细胞移植材料和制备椎间盘组织工程种子细胞材料中的应用。
2.权利要求1所述的脐带华通胶间充质干细胞的应用包括以下方法步骤以分娩后新生儿脐带为材料制备华通胶间充质干细胞；以实施椎间盘摘除术被摘除遗弃的椎间盘标本为材料分离培养正常髓核细胞；以与髓核细胞共培养方法诱导分化脐带华通胶间充质干细胞。
3.根据权利要求2所述的脐带华通胶间充质干细胞的应用，其特征在于，所述脐带华通胶间充质干细胞的制备包括以下步骤取脐带血管之间以及血管与外膜之间的华通胶组织，经胶原酶消化18小时、胰蛋白酶消化30分钟，用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行传代培养。
4.根据权利要求2所述的脐带华通胶间充质干细胞的应用，其特征在于，所述正常髓核细胞的分离培养包括以下步骤取新鲜椎间盘标本分离髓核组织，经II型胶原酶溶液消化5小时，再以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。
5.根据权利要求2所述的脐带华通胶间充质干细胞的应用，其特征在于，所述以与髓核细胞共培养方法诱导分化脐带华通胶间充质干细胞的方法为非接触式方法，具体工艺步骤为使用聚对苯二甲酸乙酯制作的、孔径大小为0. 4 μ m的Transwell六孔板进行共培养， 其插入层接种髓核细胞6 X IO4,下层接种华通胶间充质干细胞2 X IO4,培养7天后，收集华通胶间充质干细胞。
6.根据权利要求2所述的脐带华通胶间充质干细胞的应用，其特征在于，所述以与髓核细胞共培养方法诱导分化脐带华通胶间充质干细胞的方法为接触式方法，具体工艺步骤为用乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯标记华通胶间充质干细胞，与髓核细胞混勻，接种于普通六孔板，细胞接种密度为6. 0 X IOVcm2 ；培养7天后进行细胞分选，收集华通胶间充质干细胞。
7.根据权利要求6所述的脐带华通胶间充质干细胞的应用，其特征在于，所述以接触式诱导分化脐带华通胶间充质干细胞的方法中，接种的髓核细胞数量为华通胶间充质干细胞的3倍。
全文摘要
本发明涉及脐带华通胶间充质干细胞在制备医用生物材料中的应用。这种医用生物材料可以用于人椎间盘细胞移植，也可用作椎间盘组织工程的种子细胞。它是以新鲜人脐带为材料制备华通胶间充质干细胞，以实施椎间盘摘除术时被摘除的椎间盘标本为材料分离培养正常髓核细胞；再应用非接触式或接触式细胞共培养方法诱导分化脐带华通胶间充质干细胞。
文档编号A61L27/38GK102258809SQ20111019833
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者何勍, 吴剑宏, 张燕, 张超, 李海峰, 王德利, 王超峰, 辛洪奎, 阮狄克 申请人:中国人民解放军海军总医院