专利名称：鸭黄病毒病灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于动物疫苗领域，涉及一种鸭黄病毒病灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
“鸭黄病毒病”(暂名)又名“鸭出血性卵巢炎”、“蛋鸭黄病毒病”、“鸭高热减蛋综合征”和“新型黄病毒BYD引起的产蛋下降综合征”是2010年在中国浙江、福建、山东、广东等地首次发现的一种新鸭病，主要发生于蛋鸭、也发生于种鹅、肉鸭。蛋鸭发生此病时， 临床表现为肢体站立不稳，行走困难，采食量下降，产蛋量骤然减少，减蛋幅度很大，5天内减蛋超过90%或者绝产，部分病鸭在数日内死亡，死亡率为5% 10%。剖检病变为卵巢发生出血、萎缩、卵泡破裂或萎缩等。此前，国内外未见类似疫病。2010年藤泽泱、曹贞贞、万春和等、2011年苏敬良等证明该病病原属于黄病毒科黄病毒属鸭黄病毒(Flaviviridae， Flavivirus, Duck flavivirus)。2011年胡奇林等从广东省发生“鸭黄病毒病”的蛋鸭中分离到1株鸭黄病毒JM株， 对JM进行了鉴定，测定了 JM株部分理化和生物学特性，并进行了动物回归试验等。迄今为止，未见国内外有关“鸭黄病毒病”疫苗特别是灭活疫苗研究的报道。因此， 研制一种安全有效的“鸭黄病毒病”疫苗对我国养鸭业的发展具有重大意义。

发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭黄病毒病灭活疫苗，该灭活疫苗安全性好，免疫效果可靠。本发明的另一个目的在于提供上述疫苗的制备方法。本发明所采用的技术方案如下
一种鸭黄病毒病灭活疫苗，含有经灭活的鸭黄病毒(/ viviridae, Flavivirus, Duck fla vi virus )毒株及佐剂。优选的，所述佐剂为法国SEPPIC公司Montanide ISA 71 VG佐剂。优选的，所述鸭黄病毒毒株为鸭黄病毒JM株，已于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC V201131。上述的“鸭黄病毒病”灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤
1)将鸭黄病毒毒株的生产用种毒进行大规模培养，收获病毒液；
2)将收获的病毒液灭活；
3)将灭活后的病毒液加入佐剂中，乳化后即得。优选的，步骤1)的具体操作为将鸭黄病毒毒株的生产用种毒经尿囊腔接种 10 12日龄麻鸭胚或8 11日龄鸡胚或10 13日龄番鸭胚，37°C培养，收集接种后48 120 小时死亡胚，置于4、°C冷却414小时，无菌收获含毒尿囊液。优选的，步骤2)的具体操作为将收获的含毒尿囊液加入甲醛至总量的 0. 2% 0· 3%,于37°C灭活20 28小时。
优选的，步骤3)的具体操作为将20^40体积份灭活后的病毒液加入6(Γ80体积份的佐剂中，在高速勻浆机中乳化。鸭黄病毒JM株，已于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC V201131。本发明的有益效果在于
本发明的灭活疫苗安全性好，分别以1. 5ml/只和2. 5ml/只接种产蛋鸭后未见明显不良反应；免疫效果好，对产蛋鸭以该疫苗1. 5ml/只免疫后14天/12天用强毒进行攻击，结果，攻毒对照组从攻毒后第2天开始产蛋明显下降，第8天开始停止产蛋或者降低至20%，攻毒后17天内平均产蛋率为17. 8%/20. 3%，而本发明的疫苗免疫组攻毒后17天内平均产蛋率为67. 03%/67. 2% 71. 7%，保护率为60%/59% 65%，白油佐剂疫苗对照组攻毒后17天内平均产蛋率为29. 3%/33. 1%，保护率为14%/16. 4%，表明本发明的疫苗免疫鸭产蛋量比未免疫攻毒对照组及白油佐剂疫苗对照组鸭有显著提高，证明该疫苗能保护蛋鸭抵抗强毒的攻击，可以用于临床上预防“鸭黄病毒病”，具有重大的经济和社会效益。


图1为黄病毒科黄病毒属鸭黄病毒广东株(JM)的电镜照片(100，000X)；
图2为JM株的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图(泳道1-6均为疑似ARV临床病料、泳道7 为 ddH20，泳道 8、9、14、15 禾Π 17 分别为JMDE3、JMDE4、JMDEl、JMDE2 和 JMDE5 ；泳道 10-13 分别为NDV、ARV、IBDV和MDRV ；泳道16为DNA分子量Marker)
图3为鸭黄病毒JM株基因组ORF 7个片段基因的RT-PCR扩增结果； 图4为麻鸭感染JM株第5天后剖检照片(a为正常对照组，b为感染组。)。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例1
一、疫苗生产用毒株 1、病毒来源、保藏情况
本疫苗生产用种毒株是黄病毒科黄病毒属鸭黄病毒广东株(JM)，是本发明人于2011 年从广东省江门市发生产蛋下降的蛋鸭卵巢等组织中用麻鸭胚经尿囊腔接种分离而得，已于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC V201131。经 PCR、病毒回归试验、病毒形态电镜观察等方法鉴定。、病毒株特性
(1)鸭黄病毒JM株的形态
取含毒尿囊液JMDE4于4 °C，3000r/min离心20min后，取上清；再于4 °C，5000r/ min离心40min，取上清；上清液于4°C, 40,000r/min离心120min，取沉淀，用少量0. 01M, pH7. OPBS重悬，此重悬液即为初步纯化病毒。初步纯化病毒用2. 5%磷钨酸负染，在 JE-1200EX透射电镜下观察，结果能看到直径50nm左右，圆形的病毒粒子(如图1所示)。(2)鸭黄病毒JM株的分子生物学鉴定O) PCR鉴定
牛艮据苏敬良等 艮道(Jingliang Su, Shuang Li, Xudong Hu, et al. Duck Egg — Drop Syndrome Caused BYDVirus, aNew Tembusu-RelatedFlavivirus. PLoS ONE 6(3): el8106.)，合成了一对鸭黄病毒特异引物TV-3(f)、TV-3 (r)，预期扩增产物为401bp。病毒 RNA抽提，取含毒尿囊液JMDE3、JMDE4、JMDEl、JMDE2和JMDE5，同时用新城疫病毒等作为阴性对照，用 Takara MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4. O抽提试剂盒按使用说明书进行抽提。反转录(cDNA合成)取21ul病毒RNA抽提产物、加入Random 6mers 2ul,加 dNTPs如1，混勻，65°C，IOmin,冰浴2 3min，再在上述反转录管中加入DTT 4ul, 5XM-MLV buffer 8ul，力口入 M-MLV (Invitrogen 公司产品)，混勻，30°C，lOmin，再 37°C，60min。PCR扩增引物TV-3 (f)、TV_3 (r)的PCR扩增按以下进行反应体积25 μ 1，DEPC 水 26ul，ExTaq buffer 5ul, dNTPs 3ul，引物 TV_3 (f) 3ul，TV_3(r) 3ul, ExTaq 0.25ul，混勻后分成2份，每份20 ul，在反应体系中再加入5ulcDNA模板。PCR反应条件为94°C5min ； 940C 30sec，52°C 30sec，72°C 30sec，;35 个循环；最后，72°C延伸 lOmin。用含 Goldenview (天泽基因公司产品)的1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。结果阴性对照和水均未见任何条带，只有JM株出现预期大小的DNA片段(如图2所示)。②JM株全基因组序列分析
A 参照GenBank中已公布的鸭黄病毒BYD-I株(苏敬良等，同前)的全基因组序列， 在进行黄病毒属多序列比对分析的基础上，利用黄病毒基因组中较保守区域，应用I^rimer Premier 5. O软件设计了 7对引物，分别用于扩增约1200-1900 bp长度的鸭黄病毒基因片段(引物序列见表1)，所有引物由^witrogen合成。
权利要求
1.一种鸭黄病毒病灭活疫苗，含有经灭活的鸭黄病毒(Flaviviridae， Flavivirus, Duck flavivirus)毒株及佐剂。
2.根据权利要求1所述的鸭黄病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为法国SEPPIC 公司 Montanide ISA 71 VG 佐剂。
3.根据权利要求1所述的鸭黄病毒病灭活疫苗，其特征在于，所述鸭黄病毒毒株为鸭黄病毒JM株，已于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC V201131。
4.权利要求广3任一项所述的鸭黄病毒病灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤1)将鸭黄病毒毒株的生产用种毒进行大规模培养，收获病毒液；2)将收获的病毒液灭活；3)将灭活后的病毒液加入佐剂中，乳化后即得。
5.根据权利要求4所述的鸭黄病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)的具体操作为将鸭黄病毒毒株的生产用种毒经尿囊腔接种1(Γ12日龄麻鸭胚或8 11日龄鸡胚或1(Γ13日龄番鸭胚，37°C培养，收集接种后48 120小时死亡胚，置于4、°C冷却414小时，无菌收获含毒尿囊液。
6.根据权利要求4所述的鸭黄病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤2)的具体操作为将收获的含毒尿囊液加入甲醛至总量的0. 29ΓΟ. 3%，于37°C灭活2018小时。
7.根据权利要求4所述的鸭黄病毒病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3)的具体操作为将2(Γ40体积份灭活后的病毒液加入6(Γ80体积份的佐剂中，在高速勻浆机中乳化。
8.鸭黄病毒JM株，已于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为 CCTCC V201131。
全文摘要
本发明公开了一种鸭黄病毒病灭活疫苗及其制备方法。本发明的鸭黄病毒病灭活疫苗含有经灭活的鸭黄病毒毒株及佐剂，其制备方法如下将鸭黄病毒毒株的生产用种毒进行大规模培养，收获病毒液；将收获的病毒液灭活后加入佐剂中，乳化后即得鸭黄病毒病灭活疫苗。本发明还公开了鸭黄病毒JM株，已于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCV201131。本发明的“鸭黄病毒病”灭活疫苗安全性好，不会对鸭只产生任何不良反应；免疫效果好，能显著提高蛋鸭对鸭黄病毒的抵抗力，可以用于临床上预防“鸭黄病毒病”，具有重大的经济和社会效益。
文档编号A61K39/12GK102397539SQ20111038092
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月25日 优先权日2011年11月25日
发明者孙敏华, 李林林, 胡奇林, 董嘉文, 袁建丰 申请人:广东省农业科学院兽医研究所