专利名称：多巴胺d的制作方法
技术领域：
本发明涉及多巴胺D3受体激动剂用于生产诊断和治疗盐依赖性高血压用的药物产品的用途。
尽管肾缺陷的准确原因还不太清楚，但是已有人提出在某些类型的主要高血压中肾多巴胺受体功能和肾钠排泄减弱之间的关系(参见T.Hussain等，Hypertension，1998，32187-197)。
在人群中有约10-15％患盐依赖性高血压。诊断必需约定要求患者进食几周低盐膳食，这样当为盐依赖性高血压时高血压将降低。然而，难处之一是患者经常不能连续地保持这种膳食，这样难以作出可信的诊断。即使已经诊断出来，但是经常不能保证患者永远保持低盐膳食。
本发明的目的是发现能够简单地诊断和治疗盐依赖性高血压的药物产品。
我们已惊奇发现，多巴胺D3受体激动剂适合于生产诊断和治疗盐依赖性高血压的药物产品。
合适的多巴胺D3受体激动剂原则上是所有对该受体亚类具有选择性的激动剂。这种激动剂的一个实例是R(+)-7-羟基-2-二丙基氨基四氢萘(7 OH-DPAT)。特别合适的激动剂是显示高的周围血浆水平的那些。
通过各种动物试验已可以证实该效果。
Dahl大鼠(参见Dahl等，Nature 1962，194480-482)代表盐依赖性高血压的动物模型。可以通过高盐膳食在所谓的盐敏性Dahl大鼠(即使它们还比较幼小)中诱导高血压，而在所谓的盐抗性Dahl大鼠中不产生这种效果。
然而在盐抗性Dahl大鼠中，给予多巴胺D3受体激动剂7 OH-DPAT使得肾小球滤过速率、尿钠排泄和排泄体积增加，而在盐敏性Dahl大鼠中给药对肾功能没有影响。
盐抗性Dahl大鼠和盐敏性Dahl大鼠的多巴胺D3受体mRNA测定证实，在盐敏性Dahl大鼠中该mRNA的表达比盐抗性Dahl大鼠中少60％。
同样地，与来自盐抗性Dahl大鼠的肾的相应制品相比，在来自盐敏性Dahl大鼠的肾的膜制品中结合放射性标记的选择性多巴胺D3配体[3H]-7-OH-DPAT的能力降低约50％。
在盐抗性大鼠(定义为当它们接受高盐膳食时不患高血压)中，当这些动物接收亚慢性给予选择性多巴胺D3受体拮抗剂5-氨基-3-(4-(4-(2-叔丁基-6-三氟甲基)嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-2-甲基-丁-2-烯-1-基巯基)-4-甲基-1，2，4(4H)-三唑同时接收高盐膳食时，发现动脉血压显著增加。
由这些发现可以推断出在盐依赖性高血压发展中起决定性的是多巴胺D3受体。
可以将多巴胺D3受体激动剂用于诊断盐敏性形式的高血压。这是在标准化条件下通过口服或非肠道给予D3激动剂并测定尿量和钠排泄进行的。尿量和钠排泄增加将说明正常反应；没有这种反应将指示为盐敏性高血压。这种区别对接下来的治疗判断是重要的。
为了生产药物产品，可以将所述D3受体激动剂加工成常规药物剂量形式，例如口服、非肠道、皮下、腹膜内或局部给药用。合适形式是例如片剂、胶囊剂、输液和注射用的溶液、可饮用的形式或喷雾剂。
就所需的给药形式而言，除了该活性组分之外，该新型药剂合适地含有常规载体和稀释剂。就局部外用给药而言，可以使用药用赋形剂如乙醇、异丙醇、乙氧基化蓖麻油、乙氧基化氢化蓖麻油、聚丙烯酸、聚乙二醇、聚硬脂酸乙二酯、乙氧基化脂肪醇、液体石蜡、矿脂和羊毛脂。就内部给药而言，合适的赋形剂例如有乳糖、丙二醇、乙醇、淀粉、滑石粉和聚乙烯基吡咯烷酮。
还可以含有抗氧化剂如生育酚和丁基化的羟基苯甲醚和丁基化羟基甲苯、味道改进添加剂、稳定剂、乳化剂和润滑剂。
除活性组分外包含于制剂中的物质以及生产药物制剂所用的物质，是毒理学可接受的并且可以与各种活性组分相容。药用制剂是以常规方式生产的，例如通过将活性组分与其它常规载体和稀释剂混合。
试验用正常血压的Sprague-Dawley大鼠和两个动脉高血压的动物模型，Okamoto种的自发高血压大鼠(SHR)和盐敏性Dahl大鼠(DS)进行研究。
将雄性SHR大鼠(n＝8)及其对照组、雄性Wistar-Kyoto大鼠(WKY)，(n＝8)，8-10周龄，体重为180-260g，给食正常大鼠饲料，自由接近自来水。雄性DS大鼠(n＝10)及其正常血压对照、盐抗性Dahl大鼠(DR，n＝10)，6-7周龄且体重为100-150g，在清除率试验之前接受22-25天补充有4wt％氯化钠的大鼠饲料，同样地自由接近自来水。
清除率试验通过腹膜内注射硫喷妥钠(80mg/kg体重；来自Byk Gulden，Konstanz，DE的Trapanal)将这些大鼠麻醉并将它们放置在温热地方以便使直肠的温度为37.1℃。为了便于自发呼吸而实施气管切开术。将两根导管导入右颈静脉。将林格氏盐水(111mmol NaCl，30mmolNaHCO3，4.7mmol KCl)通过第一根导管以1.5-3.0ml/h的速度注入，相当于0.8％体重。在整个试验中，将溶于林格氏溶液中的[3H]-菊粉(1.2μCi/ml)通过第二根导管以0.6ml/h的速度注入，以便测定肾小球滤过速率。
将一套管针插入左颈动脉中以采血样并连续测定全身血压。通过膀胱导管取出尿样品。在该操作持续80-100分钟期间让大鼠休息之后，测定两个各自20分钟的连续清除阶段以确定其基线。然后将林格氏盐水的注入换成两个分别为0.01-0.1μg/kg体重/分钟的剂量注入D3受体激动剂R(+)-7-羟基-2-二丙基氨基四氢萘溶于林格氏溶液的溶液。然后再次注入林格氏溶液，并在10分钟之后进行清除阶段。在每个20分钟清除阶段的10分钟之后取出180μl血样。
通过肾[3H]-菊粉清除的方式测定肾小球滤过速率(GFR)。在该试验期间连续地测定平均动脉血压(MAP)和心率(HR)。在结束清除率试验之后，取出肾，放血并称重。通过重量法测定尿量。将血样离心并测定血细胞比容。使用由Eppendorf，Hamburg供应的ELEX6361设备通过火焰光度法测定尿和血浆中的钠浓度。通过液相闪烁法测定3H-菊粉放射活性。
结果显示，在自发高血压大鼠、正常血压WKY大鼠和盐抗性Dahl大鼠中对给药选择性D3受体激动剂产生一致且剂量依赖性反应。在这三组中的尿钠增加、利尿和肾小球滤过速率增加与盐敏性Dahl大鼠的结果明显相反。在这种动物中没有观察到因多巴胺D3受体刺激引起的肾功能变化。
多巴胺D3-mRNA和[3H]-7-OH-DPAT在肾组织中结合的研究为得到肾组织先将大鼠麻醉，使用无菌操作材料将肾暴露、取出、称重并去掉被膜。
用RT-PCR测定肾组织中的多巴胺D3-mRNA(RT-PCR逆转录酶-聚合酶链反应)在冷至4℃的HEPES下用无菌解剖刀沿前后向将两个Dahl种(DS和DR)、和SHR和WKY大鼠的肾分开(Terada等，1993)。将肾分成大小相等的3个横片并且最初在液氮中摇荡冷冻于1.5ml Eppendorf管中然后在-80℃下贮藏直到进一步制备RNA。通过Chomczynski和Sacchi的方法(1987)分离RNA。对此将组织在有酸性苯酚/氯仿混合物的情况下匀化并离心。上面水相含有该RNA。将其用异丙醇从残余苯酚中纯化并用乙醇沉淀的。然后可以加到DEPC-H2O中并在量化之后用于RT-PCR。所有步骤都是在无菌条件下进行的，并预防RNA酶污染。
在15μl混合物中将500ng的总RNA转录成互补DNA(cDNA)。接下来的RT-PCR所用的引物按照文献或者借助基因数据库中的公开序列进行选择并通过MWG-生物技术公司(Ebersberg)合成。通过Wong等(1994)所述的“引物滴下”法进行D3受体mRNA表达的相对定量。在第一阶段，将靶序列通过特定次循环扩增，以便在第二阶段中，在β-肌动蛋白的情况下加入扩增管家基因用的引物对，并且使该PCR继续其它循环。
在各种样品的PCR之后比较信号强度显示，在DS大鼠中的表达与其对照、DR大鼠中的表达存在显著差异。DS大鼠显示表达显著降低约60％。各用三只大鼠，每只进行三次RT-PCR反应进行研究(n＝3/9)。将WKY与SHR直接比较证实表达略有增加，但没有达到显著水平。然而将DS大鼠与WKY和SHR大鼠比较显示，D3-mRNA表达的显著差异更大。
7-OH-DPAT结合在正常和高盐膳食之后将两个Dahl种(DS和DR)的动物的肾在麻醉下取出之后直接于缓冲溶液(TRIS 25mM/HEPES 40mM(pH4.7)、蔗糖320mM、BDTA 0.5mM)中匀化并在1000xg下离心15分钟(4℃)。弃去上清液之后，将离心丸再次悬浮于缓冲液中并再次离心。将第二次的上清液在100,000xg下离心30分钟(4℃)。将最后的离心丸再次悬浮于没有蔗糖和EDTA的缓冲液中并在-80℃下贮藏直到进行结合试验。用100mg膜蛋白进行结合研究。用0.5-50nM[3H]-7-OH-DPAT进行饱和试验，使用10μM未标记的7-OH-DPAT测定非特异性结合。特异性结合是通过总结合减去非特异性结合计算得到的。
表示配体对其受体的亲和力的离解常数(KD)未显示出显著差异并且对两个Dahl种而言都为约10nM。而在DS中的特异性结合(bmax)比在DR中显著的低。其差异当大鼠预先接受高盐膳食时更清楚。在这种情况下，DS大鼠的特异性结合仅为DR动物的值的50％。
在盐抗性Dahl大鼠中通过抑制多巴胺D3受体诱导盐依赖性动脉高血压将正常膳食下的盐抗性Dahl大鼠(DR)用多巴胺D3拮抗剂5-氨基-3-(4-(4-(2-叔丁基-6-三氟甲基)嘧啶-4-基)哌啶-1-基)-2-甲基丁-2-烯-1-基巯基)-4-甲基-1，2，4(4H)-三唑以40mg/kg/天的剂量经饮用水处理1周。在这周之前和结束时通过尾体积法(Schwanzplethysmometrie)测定动脉血压。然后随意给动物喂食高盐膳食(饲料中4％重量NaCl)。在开始试验之后每周测定动脉血压并持续4周。
实验表明，正常盐膳食下用多巴胺D3拮抗剂处理动物对血压没有引起变化(值为约100mmHg)。然而，在高盐膳食下处理时动脉压逐渐增加，在第29天平均最大值为148mmHg，仍未达到最高状态。
权利要求
1.多巴胺D3受体激动剂用于生产诊断和治疗盐依赖性高血压的药物产品的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中将R(+)-7-羟基-2-二丙基氨基四氢萘用作多巴胺D3受体激动剂。
全文摘要
本发明涉及多巴胺D
文档编号A61K31/137GK1387450SQ00815203
公开日2002年12月25日 申请日期2000年10月31日 优先权日1999年11月4日
发明者B·米尔鲍尔 申请人:艾博特股份有限两合公司