专利名称：家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，属于昆虫抗菌肽的分离纯化技术领域。
背景技术：
昆虫每天都会直接接触、食入、吸入成千上万的病原微生物而不至于患感染性疾病，这种抵抗外来致病微生物的能力主要是通过天然免疫的防御机制得以实现。抗菌肽是所有物种中天然防御机制的重要组成部分，这类多肽可以是固有表达的，也可以被病原微生物及其产物诱导表达。
昆虫抗菌肽是一类分子量小、水溶性好、稳定、抗菌谱广且抗菌机制独特的多肽，是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的物质。不少科学家认为，昆虫具有惊人的天然免疫力，并以抗菌肽作为其宿主防御机制的主要成分。抗菌肽除有非特异性的抗病原微生物外，还有抗肿瘤细胞的作用，而对人体的正常细胞无破坏作用。因此，抗菌肽的开发和利用是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。
家蝇是重要的医学昆虫，能够机械传播人、畜多种病原菌如细菌、病毒和寄生虫卵等。目前国内外报道已从其幼虫血淋巴中分离到了多种抗细菌、真菌、原虫的生物活性抗菌蛋白/多肽，在幼虫体外分泌物中发现了广谱的抗植物病原菌、植物根结线虫及寄生虫卵的物质。但这些研究多集中于抗菌肽的诱导及活性检测阶段，而体外不同环境对其抗菌活性的影响均无报道。目前，抗菌肽的纯化方法多使用性质温和的凝胶层析，但该方法所需时间较长，每次上样量及目的蛋白的回收量较小。

发明内容
本发明的目的在于提供一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用。本发明采用透析、固相萃取、超滤和反相高效液相色谱方法从家蝇幼虫分泌物中分离到具广谱抗菌活性的肽类物质，使抗菌肽制备时间缩短，提高了分离纯化的效率，而且该抗菌肽在体外不同的环境中其抗菌活性具有较强的稳定性，可通过破坏细菌细胞膜通透性、抑制细菌体分裂、阻碍与细胞分裂相关的某些蛋白质的合成等途径发挥抗菌作用；具有提高特异性和非特异性免疫功能的作用，对细菌感染有一定的保护作用。
本发明是这样实现的家蝇分泌型抗菌肽的分离方法为将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。
所述的抗菌肽粗提液，即家蝇幼虫外分泌物粗提液的制备为取三龄家蝇幼虫置于干净大烧杯中，充分清洁体表后浸于适量蒸馏水中4小时，不时振摇；吸取浸液离心10000g×10min，上清液冷冻干燥浓缩，即得抗菌肽粗提液，4℃保存备用。
具体的分离方法为(1)透析将浓缩的抗菌肽粗提液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析过夜，其间换掉外液两次；取内液用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用；(2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脱，流速为1ml/min；各洗脱组分冷冻干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超纯水溶解，检测该洗脱组分的抗菌活性；收集、浓缩、冻干具有活性的组分，超纯水溶解，12000rpm离心10min，收集上清液-20℃保存备用；(3)超滤将固相萃取活性组分合并后加到截留分子量为3KD的超滤管中，5000×g离心30min分离；继续将未透过超滤管的组分加到截留分子量为30KD的超滤管中，同上离心，分别收集超滤管中和管下液体，将活性物质分为三个部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各组分检测蛋白浓度和抗菌活性；(4)反相高效液相色谱纯化超滤后活性组分用0.22μm微孔滤膜过滤，100μl上C18反相色谱柱，流动相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色谱柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脱条件为梯度洗脱，30min内己腈浓度从5％上升到60％流速1ml/min，手工收集214nm波长洗脱峰，即获得两个抗菌肽组分。
以上所用的Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱在加样前预用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色谱柱为Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。
上述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法分离得到的家蝇分泌型抗菌肽。
上述家蝇分泌型抗菌肽在制备提高特异性或非特异性免疫功能、抗细菌感染的药物或保健品中的应用。
上述家蝇分泌型抗菌肽在动物饲料或防腐剂中的应用。
本发明以家蝇幼虫体外分泌物为原料，采用现代分离纯化技术，对幼虫外分泌型抗菌肽的分离、纯化及其性质进行了研究，并初步探讨了该抗菌肽的抑菌机理。同时，将抗菌肽应用于正常和感染小鼠，研究其对小鼠免疫功能、血液生化指标及重要器官病理变化的影响，为昆虫抗菌肽的开发及应用提供了理论基础。
一、本发明抗菌肽的分离纯化发明人通过研究摸索到一条纯化时间短、蛋白质得率高、抗菌活性稳定及活性较好的抗菌肽提取路线首先用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析除掉粗提液中的盐及小分子杂质，透析内液进一步用0％-80％的甲醇进行固相萃取梯度洗脱，洗脱组分冷冻干燥浓缩，再经30KD超滤管超滤处理，除掉大分子的无活性成分，余下组分进一步用C18反相高效液相色谱纯化，最终在15.5min和18.5min处得到两个活性蛋白峰，紫外吸收光谱分析证明为蛋白肽类物质。整个纯化过程纯化倍数为27.93倍，活性回收率9.62％。
抗菌肽常常存在于胞浆颗粒中，其分子量较低。一般而言，提取多肽样品的方法主要有水浸提法、有机溶剂抽提法和有机酸抽提法等。本研究采用的抗菌肽提取方法是基于发明人的长期摸索，将几种纯化方法进行详细比较以后得到的较为成熟和简便的方法。
首先，考虑到家蝇幼虫分泌物粗提液中除了其分泌的抗菌肽以外，还有许多肠道的一些内容物、盐类和其他小分子物质，因此，我们利用截留分子量为3500D的透析袋将粗提液进行透析，以此除掉小分子的杂质和盐类等物质。固相萃取是目前对生物分子分离的一种常用方法，本发明使用的是Sep-Pak C18Cartridge柱，该柱能减少样品制备的时间，操作简便，快捷。可完成纯化、样品富积或浓缩、分级分离及溶剂交换等工作。在样品的分级分离中，根据分析物极性的不同，采用梯度增加溶剂强度的办法，选择性地洗脱和分离分析物。透析以后的幼虫分泌物经固相萃取后，0％、10％、20％、30％组分固体培养法和液体培养法均没有显示抗菌活性，而40％-50％组分活性弱且不稳定，仅60％～80％组分具有较强抗菌活性，而且活性非常稳定。发明人前期在摸索固相萃取条件的同时也采用凝胶层析的老方法来分离分泌物抗菌肽，但综合比较，效果始终不如固相萃取好，主要是后者所需时间长，层析后样品还需要脱盐，而且活性的稳定性也没有萃取高，因此，本发明最终选择了固相萃取来分离抗菌肽。
超滤是一种膜分离的单元操作，它是利用膜的选择性，溶液各组分透过膜的迁移率不同而分离，在分离中被传递的是溶剂，属于速率控制的传质过程，具有操作方便，无相变，无化学变化，处理效率高和节能等优点。发明人将萃取活性组分合并后，分步使用截留分子量为3KD和30KD的超滤管，发现活性组分分子量介于3-30KD间，符合前人研究的结论。
高效液相色谱在生物分子的分离纯化中具有独特的优点，为生物分子的分离分析提供了良好的生物兼容性，对复杂混合物的分离能力强。其分辨率极高，固定相是带有多孔的微小硅胶颗粒的表面固定上了非极性的C-8或C-18非极性基团，流动相用极性溶液如己腈、甲醇、水或低盐缓冲液等。被分离组分中极性强的大分子物质首先被洗脱，小分子物质后被洗脱，而极性小的物质则保留时间较长。抗菌肽属于极性物质，易于分配在极性流动相中。
发明人用琼脂扩散法和活菌计数法对本发明所提取的抗菌肽活性进行检测发现，该抗菌肽对条件致病菌如大肠杆菌、致病菌如金黄色葡萄球菌有抑制作用，而且对非条件治病菌枯草芽孢杆菌也有抑制作用，对标准菌株和临床分离菌株的抗菌活性无明显差异，提示其对致病菌和非致病菌的抑制作用可能没有选择性。从抑菌结果来看，首先该抗菌肽对消化道感染菌大肠埃希菌有抑制作用，提示此抗菌肽类物质可能有治疗大肠埃希菌性消化道疾病及调节消化道内菌群平衡的作用；其次，它对外伤感染菌如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等有抑制作用，提示其可以用于预防和治疗禽畜外伤感染，促进伤口愈合。在抗菌肽对多种细菌的抗菌效果检测中，可以看出对于同种不同株的细菌，作用效果基本相同，但总体而言，该抗菌肽对革兰氏阴性菌的抗菌效果要好于革兰氏阳性菌。据研究，大多已报道的抗菌肽对革兰氏阴性菌(G-)的抗菌效果强于革兰氏阳性菌(G+)，这是由于大多数抗菌肽属于中性或偏碱性蛋白，能通过与G-菌外膜上的脂多糖等负电物质相互作用，从而破坏膜结构以发挥抗菌作用。而G+菌没有脂多糖膜，只能通过表面肽聚糖中的胞壁酸、糖醛酸等带少量负电荷。本发明提取的抗菌肽对G-的抗菌效果优于G+，推测亦属于中性或偏碱性蛋白。
铜绿假单细胞菌、大肠埃希氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)等是临床上最常见的病原菌，易产生抗药性而导致临床难治性感染。对家蝇抗菌肽进行开发利用之后，将会对临床抗感染治疗，特别是对耐药菌感染的治疗发挥重要作用，同时也必将产生巨大的社会效益和经济效益。
二、本发明抗菌肽的生化特性发明人参照Hermann Schagger等(1987)和吴冠芸等的方法进行Tris-TricineSDS-PAGE，检测了本发明分离纯化所得提纯物的纯度。以分子量2,512、6,210、8,159、10,700、14,404、16,949Da为标准蛋白，先测定各种标准蛋白质的电泳相对迁移率(Rf)，然后以各种标准蛋白质分子量的对数为纵坐标，其Rf值为横坐标，作图得到标准曲线。最后，测出未知蛋白的Rf值，从标准曲线上查出该蛋白质的分子量。
首先用低分子量的Mark来检测抗菌活性物质的纯度，发现在标准最低分子量(14.4KD)条带稍下有一清晰蛋白条带，分子量小于14.4KD。考虑到目的蛋白的分子量偏小，又选用超低分子量Mark再次电泳，发现该活性组分的主要成分确实在14.4KD稍下，但同时，在8,159D和6,210D间出现了一条颜色较浅的条带，蛋白含量明显低于上一条带。该现象提示，经60％-80％甲醇洗脱得到的抗菌活性组分，主要蛋白的分子量为14.4KD以下，即抗菌活性成分不是单一物质。测定上述电泳凝胶中各种标准多肽的电泳相对迁移率(Rf)，然后以各种标准多肽分子量的对数为纵坐标，其Rf值为横坐标，作图可得到标准曲线。同样方法测得家蝇幼虫分泌物抗菌肽的Rf分别为0.7467和0.9067。根据标准曲线(y＝-1.6959x+5.4173，R＝0.9899)，计算其分子量分别为14157D和7579D。
抗菌肽的胰蛋白酶水解片段的质谱分析结果电泳条带上抗菌肽I经胰蛋白酶水解后，被水解成38个肽段，应用肽指纹图谱技术，对酶解后随机选择的片段进行质谱分析。通过Mascot查询NCBInr数据库，该抗菌肽与溶菌酶的前体(登陆号qi47117014)的氨基酸序列有一定的同源性，但序列覆盖率仅为20％，且两者分子量有明显差异，质谱测定抗菌肽I的精确分子量为14264D，而后者(抗菌肽II)分子量为16179D。
抗菌肽I水解后的肽段1为K.SQQGWTAWSTWK.YLys.Ser-Gln-Gln-Gly-Trp-Thr-Ala-Trp-Ser-Thr-Trp-Lys.Tyr赖氨酸.丝氨酸-谷胺酰胺-谷胺酰胺-甘氨酸-色氨酸-苏氨酸-丙氨酸-色氨酸-丝氨酸-苏氨酸-色氨酸-赖氨酸.酪氨酸肽段2为K.SELPQWTCIAEHESSYR.TLys.Ser-Glu-Leu-Pro-Gln-Trp-Thr-Cys-Ile-Ala-Glu-His-Glu-Ser-Ser-Tyr-Arg.Thr赖氨酸.丝氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-谷胺酰胺-色氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-组氨酸-谷氨酸-丝氨酸-丝氨酸-酪氨酸-精氨酸.苏氨酸抗菌肽I中的其余肽段和抗菌肽II中的肽段正在进一步地研究、测试之中。
通过检测抗菌肽的抑菌谱，试管稀释法测定对多株细菌的最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)；观察在不同pH值、阳离子浓度、动物血清环境中抗菌肽活性的变化；检测抗菌肽的凝血及溶血效应。结果表明家蝇分泌型抗菌肽对多株革兰氏阳性和阴性菌均有很好的抗菌效果，对标准菌株大肠埃希菌、伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC是32.74μg/ml，对铜绿色假单胞菌的MIC为16.37μg/ml，对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌的MIC为65.48μg/ml。其在中性至弱碱性(pH6-9)条件下抗菌活性较好；一价和二价阳离子对抗菌活性无明显影响；该抗菌肽在体外既无凝血效应亦无溶血效应。
三、本发明抗菌肽的体外抗菌机理通过观察抗菌肽在最小抑菌浓度(MIC)下大肠埃希菌(ATCC 25922)生长曲线、胞内酶含量及菌体蛋白质SDS-PAGE图谱的变化；透射电镜观察抗菌肽形态变化；流式细胞仪对菌体细胞周期进行分析。结果提示抗菌肽对大肠埃希菌的抑菌机理可能是1、改变细菌细胞膜的通透性；2、抑制调控细菌生长、分裂相关蛋白的合成，阻碍其分裂和生长。
四、本发明抗菌肽对小鼠免疫功能的影响检测巨噬细胞功能和胸腺、脾脏重量是观察药物对整体免疫影响的重要指标。发明人在对家蝇幼虫分泌物抗菌肽体外抗菌实验有效的前提下，检测了抗菌肽体内对小鼠免疫功能的影响，为进一步探明抗菌肽在天然免疫中的作用提供了实验依据。
为探讨抗菌肽对正常小鼠免疫功能的影响，以小白鼠为试验动物，分别采用不同浓度(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)研究了抗菌肽对小白鼠免疫器官指数、非特异性免疫功能和特异性免疫功能的影响。结果表明1、10mg/kg.d和20mg/kg.d的抗菌肽量对小鼠体重无明显影响，但对胸腺和脾脏生长有一定的促进作用，其中，中、高剂量组明显高于对照组。说明抗菌肽能促进免疫器官的生长，提高免疫器官指数。2、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞和碳粒廓清实验中，抗菌肽中、高剂量组巨噬细胞吞噬指数、吞噬百分数及小鼠碳粒廓清指数均明显高于对照组。说明抗菌肽具有提高小鼠机体的非特异性免疫的功能。3、抗菌肽中、高剂量能增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化率、二硝基氟苯(DNFB)诱导的迟发型变态反应(DTH)等细胞免疫功能来提高机体的特异性防御能力。
(一)抗菌肽的安全性评价以小白鼠为试验动物，采用改良寇氏法，计算该抗菌肽的半数致死量(LD50)，但最大给药量为200mg/kg.d动物均无中毒及死亡现象，提示该剂量下抗菌肽为基本无毒。以实验兔为对象，采用热源性试验法和刺激性试验法对抗菌肽进行热原和刺激性检查，结果表明，该抗菌肽无热源性和刺激性，以腹腔注射方法给药是安全的。
(二)抗菌肽对小鼠非特异性免疫功能的影响1.抗菌肽对小鼠体重及免疫器官指数的影响抗菌肽低剂量组(5mg/kg)小鼠的脾脏指数、胸腺指数与对照组相比，分别提高了5％和18％，体重降低了3％，但无显著性差异(P＞0.05)。中剂量组和高剂量组(10mg/kg和20mg/kg)小鼠的脾脏指数、胸腺指数与对照组相比明显增高，经统计学检验，差异有显著性(P＜0.05)，即抗菌肽对小鼠的胸腺、脾脏有一定的促生长作用，能明显提高小鼠的免疫器官重量，此作用有一定的量效关系，随着用量增加而重量增加。实验组小鼠的体重较对照组稍低一些，尤其是实验组I，但采用配对T检验对实验组和对照组的体重进行差异显著性检验，得P＞0.05，故抗菌肽低、中、高剂量组小鼠的体重与对照组相比无显著性差异。

2.抗菌肽对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响由下表可知，抗菌肽低剂量对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力没有提升作用，但中、高剂量则可明显提高腹腔巨噬细胞的吞噬百分数、吞噬指数。同时，低、中、高剂量的抗菌肽均能提高小鼠的碳粒廓清指数K和α，其中，以中、高剂量组效果较为明显。
抗菌肽对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响

抗菌肽对小鼠碳粒廓清活性的影响

*表示与生理盐水组比较差异显著性(P＜0.05)，**表示与生理盐水组比较差异极显著(P＜0.01)。
3.抗菌肽对脾脏ACP活性的影响抗菌肽低剂量组小鼠脾脏ACP活性为213.75±29.27，对照组为186.66±17.16两组相比P＞0.05，没有统计学意义。中高剂量抗菌肽组小鼠脾脏ACP活性分别为268.60±36.64和270.48±54.63，与对照组及低剂量组相比，P值均＜0.05，差异有显著性。提示中高剂量的抗菌肽作用后，能提高小鼠脾脏ACP的活性。
4.抗菌肽对小鼠血清溶菌酶活性的影响抗菌肽对小鼠血清溶菌酶含量的影响

(三)抗菌肽对小鼠特异性免疫功能的影响1.实验结果1.1抗菌肽对小鼠脾T淋巴细胞转化率的影响经ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验，结果发现，与对照组相比，抗菌肽低、中、高剂量组能显著增强ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力(见下表)，其中以中、高剂量组增强效果较好，提示5-20mg/kg的抗菌肽对小鼠细胞免疫功能均有增强作用。
抗菌肽对小鼠脾T淋巴细胞转化率的影响

1.2利用耳肿胀法测定了二硝基氟苯(DNFB)对迟发型变态反应(DTH)的诱导作用，结果表明抗菌肽中高剂量组显著增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应(见下表)。
抗菌肽对DNFB致小鼠DTH反应的影响

1.3抗菌肽对小鼠血清溶血素的影响结果见表，各实验组和对照组间血清溶血素比较差异没有显著性，提示抗菌肽的使用对小鼠血清溶血素没有明显影响。
抗菌肽对小鼠血清溶血素的影响

2结论2.1免疫器官指数脾脏和胸腺是动物的重要免疫器官。由于机体内的免疫细胞大多数分布于胸腺和脾脏中，成年动物的胸腺重量逐渐下降。因此，脾脏与胸腺重量增高，则相对的表明机体的免疫功能增强。胸腺是产生免疫的中枢淋巴器官，是T淋巴细胞分化成熟的场所，T淋巴细胞主要参与机体的细胞免疫功能，在机体自身稳定和免疫监视中起主导作用。脾脏是体内最大的淋巴器官，其免疫细胞中以B淋巴细胞为主(约占50％-60％)，B淋巴细胞主要参与体液免疫。此外，脾脏还能清除自身衰老的血细胞和免疫复合物。免疫器官的重量在一定程度上可以反映器官内淋巴细胞的数量，从而间接了解体内淋巴细胞的总体水平。如果两者的系数都增加，说明药物对细胞免疫和体液免疫都有促进作用。
本实验结果显示，抗菌肽中高剂量对小鼠的免疫器官指数均有明显的增高，从一定程度上反映了本发明抗菌肽可以增强动物的免疫功能。从不同剂量的抗菌肽作用结果来看，抗菌肽的增强免疫作用有一定剂量依赖性，低剂量效果不明显，随着剂量的增加，免疫器官指数增高明显，但并非高剂量效果总是强于中剂量。
2.2巨噬细胞吞噬功能巨噬细胞是一种非特异性免疫细胞，它能吞噬和消灭外来异物及自身衰老死亡的细胞。此外，它在免疫反应中还起到了处理抗原，传递抗原信息，调节免疫反应等重要作用。巨噬细胞功能的测定采用对碳粒廓清吞噬能力和吞噬鸡红细胞能力的检测。
碳粒廓清能力的大小是评价机体非特异免疫功能重要指标。吞噬颗粒状异物是单核-巨噬细胞系统的重要功能。肝脏和脾脏是执行此功能的主要器官，肝枯否氏细胞占吞噬量的90％，脾脏细胞占10％左右。向血液中注射一定量的碳粒悬液，其在血液中的清除速率反映了本系统细胞吞噬功能的状态。在一定浓度范围内，碳粒的清除速率与其剂量呈指数函数关系，即吞噬速率与血碳浓度成正比，而与已吞噬的碳颗粒成反比。廓清指数K反映的是碳粒清除速率。而单核-巨噬细胞系统一旦被激活，常伴有肝、脾Mφ增生，吞噬指数α以单位重量组织的吞噬活性为评价标准，排除了增生因素的影响，只评价吞噬细胞功能的活跃程度。小鼠尾静脉注射印度墨汁，其碳粒迅速被肝、脾等器官内皮网状内皮细胞吞噬而使其血浆浓度下降，因此其廓清率间接反映单核巨噬细胞系统的的吞噬功能。
本研究的结果显示，抗菌肽中高剂量可以明显提高小鼠的廓清指数，而低剂量组虽然对吞噬鸡红细胞能力有所提高，但与对照组相比无统计学上的意义(P＞0.05)。小鼠碳粒廓清实验和腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，虽然都能反应机体免疫系统的吞噬功能，但因二者实验方法不同，免疫作用的场所也不一样，被吞噬异物的种类不同，引起吞噬细胞游走及杀灭异物的机理也不同，本实验中两者结果基本相符，提示抗菌肽可以增强小鼠的非特异性免疫功能。
2.3脾脏ACP的活性巨噬细胞消化率的强弱，主要由巨噬细胞内溶酶体数量及其几十种酶含量的多少来决定，其中，酸性磷酸酶(ACP)是溶酶体的标志酶，在消化异物及细胞代谢方面起着重要作用。ACP活性的增强是巨噬细胞激活的一个主要标志。增强巨噬细胞的吞噬消化功能，就意味着提高机体的非特异性免疫力。巨噬细胞与淋巴细胞关系密切，前者具有摄取抗原的功能，而后者不易直接摄取抗原，通过巨噬细胞来传递抗原的免疫信息。因此，巨噬细胞在机体抵抗病原入侵的过程中发挥着重要作用，其处理抗原作用的强弱，可影响到机体的特异性免疫。
脾脏是机体最大的淋巴器官，其中的巨噬细胞来源于骨髓中的髓样干细胞，通过血流不断流入，称为游走和固定巨噬细胞。血液中的单核细胞进入脾脏，在局部微环境的影响下分化成熟，成为巨噬细胞。巨噬细胞体积增大，细胞表面脊状突起增多，胞内有完善的细胞器，且溶酶体、线粒体增多，通过吞噬和细胞内杀伤而发挥抗感染作用，但只有活化的巨噬细胞才有强大的杀灭能力。本实验选择了脾脏中的标志酶ACP的活性来观察巨噬细胞活性的高低，从而进一步估计机体非特异性免疫功能的强弱。
本实验结果显示，中剂量和高剂量的抗菌肽对正常小鼠脾脏ACP活性均显著提高，分别比对照组提高了43％和44％，说明二者都能增强正常小鼠脾脏中巨噬细胞的活性，从而促进小鼠的非特异性免疫功能。
2.4溶菌酶的活力小鼠巨噬细胞吞噬的外源性物质在细胞内消化分解主要是依靠胞内的酶系统来完成，溶菌酶就是这个酶系统中具有重要作用的酶之一。
小鼠经卡介苗(BCG)免疫后血清溶菌酶水平明显升高，进一步研究发现，血清溶菌酶活性达高峰时，经金黄色葡萄球菌感染的小鼠死亡率最低，说明血清溶菌酶水平同抗感染力有一定的关系。溶菌酶除了在抗菌方面有重要作用外，还能够激活单核细胞，增加PMNS和巨噬细胞的吞噬功能及巨噬细胞的抗原呈递功能。
因此，本发明家蝇幼虫分泌物抗菌肽增强吞噬细胞的吞噬功能可能是多种原因综合作用的结果，其途径可能是①激活巨噬细胞；②促进功能细胞分泌溶菌酶；③提高溶菌酶的活性等。
2.5脾T淋巴细胞增殖能力脾脏是机体最大的外周免疫器官，也是T、B淋巴细胞定居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所，以刀豆蛋白A(ConA)为代表的有丝分裂原能非特异性的诱导T淋巴细胞活化，导致细胞因子合成，细胞因子受体表达及最终活化增殖。T淋巴细胞在体外培养过程中受ConA等刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，进而转化为较大的淋巴母细胞。转化率的高低反应机体细胞免疫水平。ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验中，T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶可将MTT(一种淡黄色的唑氮盐)分解为蓝紫色结晶而显色，其光密度值的变化能反应细胞的增殖情况。从实验结果可知，各剂量组都有不同程度的提高T淋巴细胞增殖能力的作用，以中高剂量组效果较明显。
2.6迟发型变态反应迟发型变态反应即T淋巴细胞受抗原刺激后，分化为特异性的致敏淋巴细胞，当有相同抗原再次侵入时，引起局部致敏淋巴细胞释放出多种淋巴因子，导致以单核细胞浸润为主的炎症反应，表现为皮肤红肿，硬结。炎症反应的程度可以衡量机体对该抗原特异性细胞免疫力的大小。
2.7血清溶血素的测定血清溶血素是检测机体体液免疫功能的一个指标，是抗体生成细胞检测试验之一。用抗原(SRBC)免疫动物后，B淋巴细胞受到SRBC刺激后，分化为浆细胞，浆细胞产生抗SRBC抗体(溶血素)，当再次与SRBC一起孵育，在补体的参与下，可使羊红细胞发生溶血反应，并释放血红蛋白。Yasuji等从中国柞蚕中提取的抗菌肽D，能促进鼠造血细胞的生长、功能与分化作用，还能调节淋巴细胞DNA的合成，以及粒性白细胞和巨噬细胞的群体形成，也能应能影响B细胞抗体的产量。
本实验结果显示，抗菌肽对小鼠血清溶血素的含量没有明显的影响。
总结上述结果，本发明家蝇幼虫分泌物抗菌肽能显著增强正常小鼠非特异性免疫功能，并有利于调节免疫平衡。
五、本发明抗菌肽对细菌感染小鼠的干预性研究本实验利用大肠埃希菌感染小鼠的疾病动物模型，从家蝇幼虫分泌物抗菌肽干预后动物的生理、生化及病理变化等几个角度初步研究了抗菌肽的体内作用，为抗菌肽在动物体内的作用提供了实验依据。
通过建立小鼠腹腔感染大肠埃希菌的动物模型，按抗菌肽预防性干预组(感染前3天预防性给抗菌肽10mg/kg.d)、治疗性干预组(感染后予抗菌肽10mg/kg)和对照组(予生理盐水)给不同处理。首先，观察感染后动物的一般情况，检测感染后不同时间段(4h、8h、12h、24h)腹腔液细菌计数；其次，检测小鼠血清内毒素、溶菌酶、一氧化氮(NO)含量，小鼠外周血TNF-α、IL-6等细胞因子水平；最后，比较了各组小鼠肝、肺、肾等重要脏器的病理形态学变化。
(一)抗菌肽对细菌感染小鼠血清TNF-α、IL-6、NO、内毒素水平的影响1.抗菌肽对细菌感染小鼠细胞因子的影响细菌感染小鼠后，4h内血清TNF-α的含量急剧上升，从正常小鼠的23.3pg/ml增加到158.56pg/ml，而给予家蝇幼虫抗菌肽后，TNF-α含量均有不同程度的下降，尤其以预防性给药组较为明显，经统计学检验，各时间段的TNF-α含量与模型组相比差异均有显著性(P＜0.05)。
抗菌肽对小鼠血清TNF-α含量的影响

抗菌肽对小鼠血清IL-6含量的影响

2.抗菌肽对小鼠血清NO含量的影响抗菌肽对小鼠血清NO含量的影响

3.抗菌肽对小鼠血清内毒素含量的影响抗菌肽对小鼠血清内毒素含量的影响

(二)抗菌肽对小鼠腹腔液细菌数及器官组织结构的影响
1.腹腔液细菌计数给细菌后4h，模型组小鼠腹腔液菌落计数可达4949CFU/μl，12h后降低为1594CFU/μl，而同期预防性和治疗性给抗菌肽组小鼠的细菌数明显少于模型组，其中以预防性给药组效果尤为明显，两者与模型组相比较均P＜0.01，差异有极显著性。
抗菌肽对细菌感染小鼠腹腔液细菌数的影响

本实验结果显示，感染细菌后，模型组小鼠腹腔液细菌量从4h的4949CFU/μl，降到12h的1594CFU/μl，说明小鼠依靠自身的免疫力可以消灭一定的细菌，而抗菌肽组小鼠的细菌量明显低于模型组，提示腹腔给予抗菌肽后，抗菌肽在小鼠体内发挥了一定的抗细菌作用，可以杀灭细菌或抑制细菌繁殖，这个作用与机体的自身免疫力结合，最终增强了机体杀菌的功效。预防性给药组小鼠的细菌量最少，可能是因为感染前给予的抗菌肽在一定程度上提高了机体的抗感染能力所致。
2.各组小鼠肺组织学的变化大肠埃希菌感染8h后，小鼠肺泡隔增厚，有炎症细胞浸润，可见肺组织淤血、出血及肺气肿；感染后24h，小鼠肺组织损伤更加明显，肺泡间隔明显增厚，有大量炎症细胞浸润，可见明显的肺出血及肺气肿。抗菌肽预防组，小鼠肺泡也有炎症细胞浸润，肺泡隔有一定程度的增厚，但均较模型组明显减轻，治疗性给抗菌肽组炎症程度介于抗菌肽预防组及模型组之间。
对器官组织结构进行观察结果显示，家蝇幼虫分泌物抗菌肽减轻了细菌内毒素引起的肺、肝的组织损伤。
上述实验结果表明对感染小鼠予抗菌肽干预后，能减少腹腔液的细菌数量，以预防性给药后效果较好。同时抗菌肽能降低感染小鼠血清TNF-a、IL-6、NO、内毒素含量；还可以在不同程度上降低感染对重要脏器的损害。
与现有技术相比，本发明采用透析、固相萃取、超滤和反相高效液相色谱方法分离纯化家蝇幼虫分泌型抗菌肽，提供了一条简便、快捷、高效、蛋白质得率高、抗菌活性稳定及活性较好的抗菌肽提取路线，使抗菌肽制备时间缩短，提高了分离纯化的效率。而且该抗菌肽具有提高特异性和非特异性免疫功能的作用，对细菌感染有一定的保护作用，为抗菌肽在制备药物、保健品以及动物饲料或防腐剂中的应用奠定了基础。
具体实施例方式本发明的实施例1取三龄家蝇幼虫置于干净大烧杯中，充分清洁体表后浸于适量蒸馏水中4小时，不时振摇；吸取浸液离心10000g×10min，上清液冷冻干燥浓缩，即得抗菌肽粗提液，4℃保存备用(1)透析将浓缩的抗菌肽粗提液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析过夜，其间换掉外液两次；取内液用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用。(2)固相萃取Sep-pak C18Cartridge固相萃取小柱用4ml甲醇活化后，4ml0.05％三氟乙酸平衡。取透析后抗菌肽粗提液1.5ml上柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸(TFA)溶液分步洗脱，流速为1ml/min；各洗脱组分冷冻干燥除掉甲醇(ACN)和三氟乙酸(TFA)后，超纯水溶解，检测该洗脱组分的抗菌活性；收集、浓缩、冻干具有活性的组分，超纯水溶解，12000rpm离心10min，收集上清液-20℃保存备用。(3)超滤将固相萃取活性组分合并后加到截留分子量为3KD的超滤管中，5000×g离心30min分离，透过超滤管的部分为分子量小于3KD的组分；继续将未透过超滤管的组分加到截留分子量为30KD的超滤管中，同上离心，分别收集超滤管中和管下液体，将活性物质分为三个部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各组分检测蛋白浓度和抗菌活性。(4)反相高效液相色谱纯化超滤后活性组分用0.22μm微孔滤膜过滤，100μl上C18反相色谱柱(Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm)。流动相A0.1％三氟乙酸(TFA)-水溶液；B0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇(ACN)溶液；色谱柱用5％甲醇(CAN)-0.1％三氟乙酸(TFA)溶液平衡，洗脱条件如下梯度洗脱，30min内己腈浓度由5％上升至60％，流速1ml/min，手工收集214nm波长洗脱峰，即获得两个抗菌肽组分。所得抗菌肽经冻干之后为白色粉末状固体。
本发明的实施例2将实施例1所得的抗菌肽1g和市兽的普通肉鸡饲料1Kg混合，每天喂养肉鸡2-3次，连续喂养30天，与添加中草药抗生素喂养的肉鸡相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面差异均无显著性，表明本发明抗菌肽有促进生长和提高免疫力的作用。
本发明的实施例3将实施例1所得的抗菌肽1g和市兽的肉猪饲料1Kg混合，每天喂养肉猪23次，连续喂养30天，与添加中草药抗生素饲料喂养的肉猪相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面差异均无显著性。
本发明的实施例4将实施例1所得的抗菌肽用蒸馏水溶解后，加入食用表面活性剂溶液，完全溶解，用泵定量加入到高剪切搅拌的去离子水中，然后搅拌成熟，过滤，得到乳化液，该乳化液可作为防腐剂应用于食品、药品等的防腐。
本发明的实施例5本发明抗菌肽20％、羟基酯类防腐剂1％、聚乙二醇400或丙二醇2.5％、氯化钠0.6％、余量为水(所述百分比均为重量百分比)取羟基酯类防腐剂溶解于适量水中，加热至45℃左右使之全部溶解；再加入聚乙二醇400或丙二醇、氯化钠，搅拌使全部溶解，高温灭菌，制成辅料溶液；将实施例1所得的抗菌肽加入辅料溶液中，添加水至全量，混匀，分装于定量喷雾器中，即得喷雾制剂。该制剂可用于治疗外伤感染。
权利要求
1.一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。
2.按照权利要求1所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于所述的抗菌肽粗提液，即家蝇幼虫外分泌物粗提液的制备为取三龄家蝇幼虫置于干净大烧杯中，充分清洁体表后浸于适量蒸馏水中4小时，不时振摇；吸取浸液离心10000g×10min，上清液冷冻干燥浓缩，即得抗菌肽粗提液，4℃保存备用。
3.按照权利要求1所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于(1)透析将浓缩的抗菌肽粗提液用截留分子量为3500道尔顿的透析袋透析过夜，其间换掉外液两次；取内液用0.22μm的无菌滤器过滤除菌，-20℃保存备用；(2)固相萃取取透析后抗菌肽粗提液上Sep-pak C18 Cartridge固相萃取小柱，依次用5ml含0％～80％甲醇的0.05％三氟乙酸溶液分步洗脱，流速为1ml/min；各洗脱组分冷冻干燥除掉甲醇和三氟乙酸后，超纯水溶解，检测该洗脱组分的抗菌活性；收集、浓缩、冻干具有活性的组分，超纯水溶解，12000rpm离心10min，收集上清液20℃保存备用；(3)超滤将固相萃取活性组分合并后加到截留分子量为3KD的超滤管中，5000×g离心30min分离；继续将未透过超滤管的组分加到截留分子量为30KD的超滤管中，同上离心，分别收集超滤管中和管下液体，将活性物质分为三个部分分子量＞30KD、3～30KD、＜3KD，取各组分检测蛋白浓度和抗菌活性；(4)反相高效液相色谱纯化超滤后活性组分用0.22μm微孔滤膜过滤，100μl上C18反相色谱柱，流动相A0.1％三氟乙酸-水溶液；B0.1％三氟乙酸-甲醇溶液；色谱柱用5％甲醇-0.1％三氟乙酸溶液平衡，洗脱条件为梯度洗脱，30min内已腈浓度从5％上升到60％；流速1ml/min，手工收集214nm波长洗脱峰，即获得两个抗菌肽组分。
4.按照权利要求3所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法，其特征在于所用的Sep-pak C18 Cartridge固相萃取小柱在加样前预用4ml甲醇活化、4ml0.05％三氟乙酸-水平衡；所用的C18反相色谱柱为Beckman，System Gold，U.S.A.，ODS 0.5μm，0.46×25cm。
5.如权利要求1-3中任一项所述家蝇分泌型抗菌肽的分离方法分离得到的家蝇分泌型抗菌肽。
6.如权利要求5所述家蝇分泌型抗菌肽在制备提高特异性或非特异性免疫功能、抗细菌感染的药物或保健品中的应用。
7.如权利要求5所述家蝇分泌型抗菌肽在动物饲料或防腐剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种家蝇分泌型抗菌肽的分离方法及其产品和应用，将抗菌肽粗提液进行透析，透析内液经固相萃取，洗脱组分经超滤分离，活性组分进一步用反相高效液相色谱纯化出两个抗菌活性组分，即得家蝇分泌型抗菌肽。本发明提供了一条简便、快捷、高效、蛋白质得率高、抗菌活性稳定及活性较好的抗菌肽提取路线，使抗菌肽制备时间缩短，提高了分离纯化的效率。而且经实验证明该抗菌肽具有提高特异性和非特异性免疫功能的作用，对细菌感染有一定的保护作用，为抗菌肽在制备药物、保健品以及动物饲料或防腐剂中的应用奠定了基础。
文档编号A61P31/00GK101054408SQ20071020037
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月2日 优先权日2007年4月2日
发明者吴建伟, 国果, 宋智魁, 付萍, 秦容贵, 张勇 申请人:贵阳医学院