专利名称：人体免疫活性细胞dccik抗肿瘤细胞制剂的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及人体免疫活性细胞(DCCIK)制剂的制备方法及应用。
背景技术：
免疫治疗已被公认是肿瘤手术、化疗和放疗之外的最为重要的手段，对清除肿瘤患者体内的微转移肿瘤细胞，防止肿瘤的转移和复发以及提高患者生存率和生活质量具重要作用。肿瘤的特异性主动免疫治疗和被动过继免疫治疗研究。近20年来，取得了巨大进步(1)鉴定和纯化了起免疫活化功能的细胞因子(Miller DL，et al.Science.1982；215689-390)，它可以增强机体对癌细胞的免疫应答。(2)开发出能选择性高效扩增特异性免疫效应细胞的方法，即获得大量特异性具杀伤肿瘤的T和NK细胞(GrimmEA，et al.J Exp Med.1982；1551823-1941)，用于免疫治疗。(3)获得并了解了各种肿瘤特异性抗原的分子特性，例如MUC(Ioannides CG，et al.J Immunol.1993；1513693-3703)和PSA(Vesey SG，et al.Urology.1990；35483-486)等。(4)证实树突状细胞(Dendritic Cell，DC)是一个关键的抗原提呈细胞(AntigenPresenting Cells，APC)(Steinman RM.Annu Rev Immunol.1991；9271-296)起调控免疫作用。(5)认识到肿瘤细胞具有发展各种方式以逃避免疫系统的能力(Khong HT，et al.Nat Immunol.2002；3999-1005)。(6)确证免疫系统在剔除具有免疫-刺激抗原的肿瘤细胞中起重要作用(Shan Karan V，et al.Nature，2001；4101107-1111)。
上述这些免疫学的进步使研究者认识到设法启动机体自身的免疫应答来消灭恶性肿瘤在体内的生长是确实可行的。
在肿瘤的过继免疫治疗中，前后出现了5种用于治疗肿瘤的免疫活性效应细胞。(1)淋巴因子激活的杀伤细胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)(Rosenberg SA，et al.N.Engl.J.Med.1985；3131485-1492)。(2)肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltrating lymphocyte，TIL)(Itok，et al.J.Exp.Med.1988；1681419-1441)。(3)抗白细胞分化抗原-3单抗激活的杀伤细胞(Anti-CD3McAb activated killer cell，CD3-AK)(Uberti JP，et al.Clin.Immunol.Immunother.1994；70234-240)。(4)细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)(Aruga A，et al.Int.J.Cancer.1991；4919-24)。(5)细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK)(Schmidt-Wolf IGH，et al.J.Exp.Med.1991；174139-149)。
对上述5种免疫活性制剂用于临床治疗肿瘤后发现(1)尽管LAK在小鼠肿瘤实验中获巨大成功，但在临床应用，因其对IL-2的严重依赖性，可产生全身性毒性，这限制它在人体上的广泛应用。
(2)CTL和TIL，特别是CTL，从理论讲上是最被看好的免疫活性细胞，但因目前尚无法获得足够临床所需之数量，以及其他限制因素而应用较少。
(3)CD3-AK和CIK，两者都是用抗CD3单抗为刺激因子来刺激T淋巴细胞增殖，几乎具有相同的增殖活性和对肿瘤细胞的杀伤能力，但CIK细胞还有赖于其他细胞因子的参与，因此CIK要比CD3-AK有更强的增殖和细胞毒活性。CIK细胞胞质中含有大量颗粒，内含酯酶、穿孔素、细胞溶解素等，可使靶细胞发生溶解和死亡。CIK细胞还分泌多种细胞因子和上调粘附分子的表达能增加效应细胞的抗肿瘤作用。
树突状细胞(Dendritic cell，DC)是近来所发现的最为重要的免疫调控和辅助细胞，它是最主要的抗原提呈细胞，具有捕获，加工处理抗原并向T淋巴细胞提呈抗原分子的功能，并表达共刺激分子和粘附分子；且能分泌在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用的Th1型细胞因子IL-12，诱导机体产生抗原特异性T淋巴细胞，认别和杀伤肿瘤细胞。
人们又发现当在CIK细胞培养时加入肿瘤患者自体的DC后，彼此能相互作用，促进双方细胞的成熟，并诱导出比同源CIK细胞更强增殖活性和更高肿瘤细胞杀伤活性的细胞群(Marten A，et al.J Immunother.2001；24(6)502-510)。
本发明人在对T淋巴细胞增殖特性研究的基础上，把DC与CIK进行共培养，发现可产生出一个比原CIK细胞更为高的增殖率和更强抑瘤细胞毒活性的细胞群。并把该新型细胞定命为DCCIK(免疫活性细胞)，本发明人用该DCCIK在人体肺腺癌裸鼠动物模型证实DCCIK实验组比CIK和生理盐水(NC)两对照组有显著差异，其生存期分别为60±78；40.5±5.6和19.8±1.2(P＜0.01)，并证实DCCIK细胞免疫治疗可以改善带瘤(肺癌、肝癌、黑色素瘤)裸鼠化疗的效果，两者有协同抑瘤效果，可使瘤体缩小和消失而单纯化疗组只有缩小无消失现象。这表明DCCIK对多种肿瘤有治疗意义，提示在临床上选用DCCIK作为肿瘤病人的免疫治疗制剂将比CIK细胞更具优势。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计制备DCCIK细胞制剂。
本发明提供了一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂，该细胞制剂使用患者自体外周血来源的PBMC，经培养分离获得粘附和非粘附两类细胞，再经相关细胞因子诱导分别产生DC和CIK细胞。用α-Galcer或CI冲击DC后再与CIK按比例进行共培养，即获得CD3+CD56+为主的一个免疫活性细胞群(DCCIK)。
本发明DCCIK的创新是使用了α-Galcer糖脂质和CI钙离子载体来多次冲击共培前的DC，使DC对其进行捕获、加工处理在与CIK共培时向T淋巴细胞提呈该抗原分子进行信号转导，在DC与CIK的相互接触反应中使多基因活化表达和释放更多的细胞因子及上调T淋巴细胞中的CD3+CD56+比例，这将极大地增强了DCCIK对肿瘤靶细胞的细胞毒杀伤活性。
本发明提供了人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂的制备方法，该方法包括下列步骤(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血，用生理盐水对倍稀释后，用淋巴细胞分离液Ficoll，1.077，离心2000rpm×25’，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×106/ml细胞悬液。
(2)非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培养2h，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞就留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ1000U/ml AIM-V培养液的25cm2培养瓶100ml/瓶，置37℃，5％CO2培养箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm2培养瓶，同时加入终浓度IL-1β100U/ml AIM-V，IL-2 300U/mlAIM-V继续培养48h，镜下计数，用CIK培液调细胞密度为4×105/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，培养至第5-7天即收集CIK细胞备用；抗CD3单抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5～10μg/ml的包被液，在25cm2培养瓶中加入5ml包被液，4℃过夜或者37℃温育2h后，弃去全部包被液即可；(4)粘附DC细胞的诱导和扩增在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml内含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培养2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，连续刺激3天以后，于第5-7天收集细胞备用；(5)DC与CIK 1∶5混合共培养制取DCCIK细胞取培养至第5天之DC和CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用AIM-V无血清培养液调两细胞的密度分别为2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等体积混合后移入25cm2培养瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培养，每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后即可获5×109～1×1010的DCCIK细胞；(6)DCCIK细胞制剂离心收集1～5×109细胞，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液制剂，留样，进行各项指标的检定，凡合格者，低温保存，待用。
本发明应用共培养得到的DCCIK细胞与LAK、CIK细胞一样均为非均质细胞群，其主要生物学特性如下(1)细胞组成DCCIK细胞中T淋巴细胞大于90％以上和少量DC。T淋巴细胞中各亚群所占比例具有个体差异和因体外培养时间长短而有一定变化范围，一般为CD3-CD56+T细胞(NK细胞)为20～40％，CD3+CD8+细胞为20～50％，CD3+CD56+(NKT)细胞为50～70％。
(2)增殖活性高DCCIK细胞的增殖活性比CIK细胞强大，体外扩增3～4周后，DCCIK细胞比同源CIK细胞和LAK细胞分别大2～4倍和20～40倍。
(3)释放细胞因子量大DCCIK细胞释放IFN-γ的量是同源CIK细胞的2～5倍。
(4)细胞毒性高与同源CIK细胞比较，DCCIK细胞体外对特异性靶细胞的杀伤作用高出10～20％，表现对同源恶性细胞的特异性杀伤，人癌动物模型治疗实验表明，DCCIK组动物的平均生存期约是CIK组动物的1～2倍(见动物试验数据统计表)。
实验组No.1接种生理盐水(N.S)对照组No.2 CIK实验组No.3 DCCIK实验组方法每只动物接种A549 3×105个细胞，接种后24h、72h、144h分别尾部静脉给生理盐水、CIK细胞(5×106)、DCCIK(5×106)，以生存天数作为观察指标来考察3组实验的致瘤情况和疗效。
CIK与DCCIK对A549肿瘤动物生存期的影响

可见，CIK组和DCCIK组分别与对照组相比其P值均小于0.001，实验组与对照组之间存在有非常显著的差异，且CIK组和DCCIK组之间也有显著差异(P＜0.01)。结果表明CIK和DCCIK都显示了对A549肿瘤的强烈抑制作用，其生存期CIK组比对照组的生存期延长了1倍多，而DCCIK组比对照组延长了几近2倍。说明DCCIK组比CIK组展示出更强的抑瘤力，提示在临床上选用DCCIK做肿瘤病人的免疫治疗制剂将比CIK更有优势。
DCCIK细胞制剂主要用于自体肿瘤的临床治疗，可以配合术后和放、化疗后的辅助治疗能有效防转肿瘤的转移和复发。此外，DCCIK细胞也可用于某些传染性疾病和中毒性化学损伤，有较好的临床应用前景。
具体实施例方式
以下通过具体实施例，对本发明作进一步说明1.外周血单个核细胞(PBMC)的制备无菌条件下用血分器取确诊的肿瘤患者抗凝外周血，用生理盐水(0.9％NaCl)等倍稀释后，用淋巴细胞分离液(Ficoll，1.077)，离心(2000rpm×25’)，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培液(AIM-V)调节细胞密度使成4×106/ml细胞悬液。
2.非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板(Nuclon)，置37℃，5％CO2培养2-6h，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用；而粘附细胞就留在6孔板上，加入DC培养液(3ml/孔)。
3.非粘附(CIK)细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ(1000U/ml)AIM-V培养液的25cm2培养瓶(100ml/瓶)，置37℃，5％CO2培养箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗(5μg/ml)包被*25cm2培养瓶，同时加入终浓度IL-1β(100U/ml AIM-V)，IL-2(300U/ml AIM-V)继续培养48-72h，镜下计数。用CIK培液调细胞密度为4×105/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，培养至第5-7天即收集CIK细胞备用。
4.粘附(DC)细胞的诱导和扩增在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml，内含有GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)，于37℃，5％CO2培养2天后，在各孔添加Galcer(100ng/ml)或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，连续刺激3天以后，于第5-7天收集细胞备用。
5.DC与CIK(1∶5混合)共培养制取DCCIK细胞取培养至第5-7天之DC和CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用AIM-V无血清培养液调两细胞的密度分别为2×105和1×106(DC∶CIK＝1∶5)等体积混合后移入25cm2培养瓶(10ml/瓶)，于37℃，5％CO2培养，每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后，即可获5×109～1×1010的DCCIK细胞。
6.DCCIK细胞制剂离心收集1～2×109细胞，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加入2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液，留样，进行各项指标的检定，凡合格者，低温保存，待用。
权利要求
1.一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂，其特征在于该制剂是通过下列方法制得的，(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血，用生理盐水对倍稀释后，用淋巴细胞分离液Ficoll，1.077，离心2000rpm×25’，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×106/ml细胞悬液；(2)非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培养2-6h，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞就留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ 1000U/ml AIM-V培养液的25cm2培养瓶，100ml/瓶，置37℃，5％CO2培箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm2培养瓶，同时加入终浓度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/mlAIM-V继续培养48-72h，镜下计数，用CIK培养液调细胞密度为4×105/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，培养至第5-7天即收集CIK细胞备用；抗CD3单抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5～10μg/ml的包被液，在25cm2培瓶中加入5ml包被液，4℃过夜或者37℃温育2h后，弃去全部包被液即可；(4)粘附DC细胞的诱导和扩增在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml内含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培养2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，连续刺激3天后，于第5-7天收集细胞备用；(5)DC与CIK 1∶5混合共培养制取DCCIK细胞取培养至第5-7天之DC和CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用AIM-V无血清培液调两细胞的密度分别为2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等体积混合后移入25cm2培养瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培养，每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后即可获5×109～1×1010的DCCIK细胞；(6)DCCIK细胞制剂离心收集1～5×109细胞，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液制剂。
2.一种人体免疫活性细胞DCCIK抗肿瘤细胞制剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)外周血单个核细胞PBMC的制备无菌条件下用血分器取肿瘤患者抗凝外周血，用生理盐水等倍稀释后，用淋巴细胞分离液Ficoll，1.077，离心2000rpm×25’，分离得PBMC，再用Hanks液洗涤2次，镜下计细胞数，最后用无血清培养液AIM-V调节细胞密度使成4×106/ml细胞悬液；(2)非粘附与粘附细胞分离将细胞悬液移入6孔板Nuclon，37℃，5％CO2，培养2h，然后用移液管轻轻冲吸细胞，将非粘附细胞悬液收集在离心管中作诱导CIK细胞备用，粘附细胞就留在6孔板上，加入DC培养液3ml/孔待用；(3)非粘附CIK细胞的诱导和扩增把离心管中的非粘附细胞悬液接种到含有IFN-γ1000U/ml AIM-V培养液的25cm2培养瓶10-15ml/瓶，置37℃，5％CO2培养箱中24-36h后，把用Hanks液配制的抗CD3单抗5μg/ml包被25cm2培养瓶，同时加入终浓度IL-1β 100U/ml AIM-V，IL-2300U/ml AIM-V继续培养48-72h，镜下计数，用CIK培液调细胞密度为4×105/ml，每隔48h按上述相同条件扩增1次，培养至第5-7天即收集CIK细胞备用；抗CD3单抗包被方法在AIM-V培液中加入抗CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5～10μg/ml的包被液，在25cm2培养瓶中加入5ml包被液，4℃过夜或者37℃温育2h后，弃去全部包被液即可；(4)粘附DC细胞的诱导和扩增在留有粘附细胞的6孔板上，每孔添加DC培液3ml内含有GM-CSF 800U/ml和IL-4500U/ml，于37℃，5％CO2培养2天后，在各孔添加α-Galcer 100ng/ml或CI(200ng/ml)，每天加1次，共3次，连续刺激3天后，于第5-7天收集细胞备用；(5)DC与CIK 1∶5混合共培养制取DCCIK细胞取培养至第5-7天之DC和CIK细胞，计数，离心，分别收集DC和CIK细胞，用AIM-V无血清培养液调两细胞的密度分别为2×105和1×106，按DC∶CIK＝1∶5等体积混合后移入25cm2培养瓶10ml/瓶，于37℃，5％CO2培养，每隔48-72h按以上细胞密度分瓶扩大培养1次，经5次扩大培养后即可获5×109～1×1010的DCCIK细胞；(6)DCCIK细胞制剂离心收集1～5×109细胞，用0.9％氯化钠注射液洗涤2次，离心，弃上清，将细胞移至250ml输液瓶中，加2g人血清白蛋白和250ml 0.9％氯化钠注射液，制成细胞悬液制剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种人体免疫活性细胞DCCIK细胞制剂的制备方法，其特征在于其中所述的步骤(3)，非粘附CIK细胞的诱导和扩增，采用固相抗CD3单克隆抗体刺激的方法，包括在无血清培养AIM-V中加入抗CD3单抗，使成为抗CD3单抗浓度为5～10μg/ml的包被液，加入培养瓶，4℃过夜或37℃温育2h后，倾去全部包被液后，移入经IFN-γ处理过非粘附的细胞悬液接受抗CD3单抗的刺激。
4.根据权利要求1或2所述的一种人体免疫活性细胞DCCIK细胞制剂制备方法，其特征在于其中所述的步骤(4)，DC的诱导和扩增，除去DC培养液中除添加GM-CSF和IL-4外，还在各培养孔中添加α-Galcer 100ng/ml或CI 200ng/ml，每24h 1次，共3次。
5.一种人体免疫活性细胞DCCIK在制备抗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了人体免疫活性细胞(DCCIK)抗肿瘤细胞制剂及制备方法。该方法用有关细胞因子对取自患者外周血分别诱导成DC与CIK，在应用α－Galcer或CI对DC反复冲击后与CIK细胞按比例作混合共培养，即获DCCIK细胞。与同源CIK比较，其增殖活性和细胞毒活性均有较大提高。该DCCIK为未经相关肿瘤抗原冲击而对同源肿瘤具有特异靶向和高效广谱杀瘤作用。可有效防止肿瘤术后和放化疗后的转移和复发。在与其他疗法配合下，可延长患者生存期并改善生活质量。
文档编号A61K35/14GK1990044SQ20051011238
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日 优先权日2005年12月30日
发明者刘祥麟, 王定华 申请人:上海中科英达生物技术有限公司