专利名称：一种筛选抗细菌粘附抑制剂的方法和抗粘附口服液的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗细菌粘附抑制剂的新方法和一种抗细菌粘附口服液的制备。
背景技术：
抗生素为治疗和预防细菌感染做出了重大贡献，但是由于抗生素的广泛使用(包括滥用)，细菌耐药性问题已经成为严重威胁人类健康的重大问题。现有抗菌药物的特征是破坏细菌的生命功能，如干扰细菌细胞壁的合成、破坏细菌DNA的复制或蛋白质的合成等， 正是这些作用机制的选择压力，促进了耐药菌株的出现。为解决细菌的耐药性问题，一种新的抗菌药物研发思路逐渐形成，即研究以抑制细菌毒力因子或阻断细菌与宿主细胞的联系为作用机制的新型抗菌药物。
细菌都能表达粘附素(adhesin)，环境中的大部分细菌都能粘附到一定界面而形成固定群落。粘附素有两类，即菌毛(pili，fimbriae)和非菌毛粘附物质(afimbrial adhesin)。病原菌粘附到宿主细胞表面是细菌感染的关键步骤，比如呼吸道、泌尿道、消化道的细菌感染都涉及粘附问题。此外，在细菌形成生物膜(biof iIm)的初期，细菌粘附起重要作用。细菌生物膜能保护细菌逃避机体的免疫应答、屏蔽抗菌药物、削弱机体内部流体剪切力对细菌的作用，并引起二次感染。因此，细菌粘附抑制剂的研究近年来受到广泛关注。、
目前筛选细菌粘附抑制剂的方法主要采用结晶紫染色比色法，具体方法如下将细菌接种在含液体培养基的96孔板中，试验样本加入液体培养基中，不加样本的做阴性对照，培养一定时间后，漂洗培养板，去除悬浮细菌，自然干燥，往板孔内加入结晶紫溶液，再洗去结晶紫溶液，然后加入一定量甲醇溶液，在540nm测定吸光值，吸光值越大表明粘附在孔表面的细菌越多，抗细菌粘附抑制剂能防止细菌粘附，因此，被筛选样本如果有抑制细菌粘附的作用，则吸光值小。这种方法的优点是能一次完成多个样本的筛选，缺点是可能出现假阴性结果，因为一些样本自身可被孔表面吸附，并能被结晶紫着色，显示的吸光值并不是因细菌粘附形成的。发现更客观的方法对筛选抗细菌粘附抑制剂具有重大意义。
尽管对细菌的粘附现象及其危害已经取的较大进展，但是迄今为止，没有一种抗细菌粘附抑制剂进入临床，目前，对细菌引起的消化道、呼吸道、泌尿道感染的治疗依然依赖大剂量给予抗生素的策略，加剧了耐药菌的出现和二次感染的发生。所以发现具有抗细菌粘附的制剂具有重要的社会价值和经济利益。发明内容
本发明要解决的技术问题是制备抗细菌粘附的口服液。
本发明的另外一个目的是克服传统方法在筛选抗细菌粘附抑制剂时可能导致假阴性的缺点，本发明提供了一种能直观判断被筛选样本是否具有抗细菌粘附的方法。
本发明的技术方案一种抗细菌粘附口服液，配方包含冷水花40克、金银花60克和茯苓100克，并制成口服液。
—种抗细菌粘附口服液的制备方法，冷水花、金银花混合，水煎煮3次，合并煮液， 浓缩后干燥，得到混合水提取A ;茯苓用水煎煮，煮液冷却后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到浅黄色干粉B ;取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入 IOOml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入Iml的红茶菌菌液，置30°C培养箱静置培养 7-9天，待pH值降到4时，停止发酵，过滤得到发酵液，发酵液冷冻处理48小时，解冻后高速离心除菌，上清液无菌罐装，置4°C冰箱保存。
一种筛选抗细菌粘附抑制剂的方法，将灭菌的普通肉汤加入无菌培养皿中，放入一张五边形的无菌载玻片，载玻片的一端浸入肉汤中，另一端架在培养皿边缘上，先加入灭菌上述上清液，再加入细菌悬液，阴性对照不加样本溶液；将培养皿置37°C培养箱培养24 小时，然后，取出载玻片，在无菌水中漂洗，将接触肉汤一面火焰固定，结晶紫染色，置显微镜下观察，导出图像。
本发明达到的有益效果本发明制备的抗细菌粘附口服液能抑制大肠杆菌的粘附，最小有效浓度为1% (VA)0 小鼠实验表明，本发明的抗细菌粘附口服液能终止肠炎沙门氏菌、大肠杆菌的人工感染，能有效治疗兔尿道大肠杆菌的人工感染。志愿者试验表明，本发明的抗细菌粘附口服液具有抗肠道感染、尿道感染的作用，还具有治疗感冒的药效。
水提取A和干粉B在水中加热溶解后，口感不佳，用红茶菌发酵后，口味以酸为主， 口感得到提高。
本发明能直观显示细菌粘附的图像，直观判断被筛选样本是否抗细菌粘附。
本发明的抗细菌粘附口服液志愿者口服治疗效果 案例一，彭某，男，49岁，贵州大学教师，长期胃肠道不适，腹湾，口服本发明的抗细菌粘附口服液10毫升，仅服用3次，腹泻停止，消化功能正常，体况变好。
案例二，田某，男，34岁，贵州大学教师，感冒不适，咽喉肿痛，口服本发明的抗细菌粘附口服液20毫升，仅服用I次即痊愈。
案例三，杨某，男，17岁，中学生，因吃烤肉，上吐下泻，口服本发明的抗细菌粘附口服液10毫升，仅服用I次即痊愈。
案例四，杨某，男，49岁，贵州大学教师，尿道感染，排尿有烧妁感，尿频，口服本发明的抗细菌粘附口服液20毫升，仅服用I次即痊愈。
案例五，杨某，53岁，公务员，长期饮酒，胃肠不适多年，口服本发明的抗细菌粘附口服液10毫升，服用73次，消化功能正常，体况变好。
具体实施方式
实施例I:本发明的抗细菌粘附口服液的制备一、材料与方法(I)材料冷水花根茎采自贵阳市雷打岩峡谷、金银花采自贵阳市情人谷、茯苓购自贵州省黎平县九潮乡。冷水花根茎切碎后阴干，金银花阴干，茯苓去皮后切成丁或片，阴干备用。红茶菌购自湖南岳阳市红茶菌培育研究中心。
(2)方法冷水花干燥颈根400克、金银花600克，加水6升分三次煎煮，得到滤液 4升，浓缩得到浸膏，浸膏置水浴蒸干，得到水提物A80克。茯苓1000克用水4升分三次煎煮，得到滤液2升，静置过夜，虹吸得到上清液I. 8升，用乙酸乙酯萃取，萃取液回收后干燥得到浅黄色干粉B20克。取10克的水提取A和2克干粉B，加入IOOml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入Iml的红茶菌菌液，置30°C培养箱静置培养7天左右，待pH值降到4 时，停止发酵，过滤得到发酵液80ml。发酵液置三角烧瓶_20°C冰箱放置48小时后，室温解冻，解冻液离心(4000转/分)10分钟，收集上清液(60ml )，置三角烧瓶用硅胶塞加盖，0-4°C 冰箱保存，即为本发明的抗细菌粘附口服液。定期(7、15、30、60日)检测pH值、细菌总数、 霉菌总数、大肠杆菌数。
二、结果本发明的抗细菌粘附口服液为棕红色液体，口味酸、微苦。pH值、细菌总数、霉菌总数、 大肠杆菌数检测见表I。
权利要求
1.一种抗细菌粘附口服液，其特征在于配方包含冷水花40克、金银花60克和茯苓100克，并制成口服液。
2.如权利要求I所述的一种抗细菌粘附口服液的制备方法，其特征在于冷水花、金银花混合，水煎煮3次，合并煮液，浓缩后干燥，得到混合水提取A ;茯苓用水煎煮，煮液冷却后过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取物回收乙酸乙酯后干燥，得到浅黄色干粉B ;取10克的混合水提取A和2克干粉B，加入IOOml自来水中，加热溶解后灭菌，冷却后加入Iml的红茶菌菌液，置30°C培养箱静置培养7-9天，待pH值降到4时，停止发酵，过滤得到发酵液，发酵液冷冻处理48小时，解冻后高速离心除菌，上清液无菌罐装，置4°C冰箱保存。
3.一种筛选抗细菌粘附抑制剂的方法，其特征在于将灭菌的普通肉汤加入无菌培养皿中，放入一张五边形的无菌载玻片，载玻片的一端浸入肉汤中，另一端架在培养皿边缘上，先加入灭菌上述上清液，再加入细菌悬液，阴性对照不加样本溶液；将培养皿置37°C培养箱培养24小时，然后，取出载玻片，在无菌水中漂洗，将接触肉汤一面火焰固定，结晶紫染色，置显微镜下观察，导出图像。
全文摘要
本发明公开了一种筛选抗细菌粘附抑制剂的新方法和一种本发明的抗细菌粘附口服液的制备，本发明所述的新方法为使用特殊形状的载玻片浸入液体培养基中供细菌粘附，培养基中加入被筛选样本，通过显微图像分析判断抗细菌粘附药效；本发明涉及的抗细菌粘附口服液的原料为冷水花、金银花和茯苓，经过提取、配液、发酵、冷冻、离心工艺制备，具有抗细菌粘附、抗肠道、尿道感染和抗感冒的药效。
文档编号A61P31/04GK102973633SQ201210581948
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月28日 优先权日2012年12月28日
发明者杨再昌, 杜润孜, 陆伦维, 杨小生 申请人:贵州大学