专利名称：羟基磷灰石基生物复合支架及组织工程骨的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种羟基磷灰石基生物复合支架及其制备方法，以及由其构建的组织工程骨，属于生物医用材料领域。
背景技术：
在生命活动中由外伤、感染、肿瘤及先天性疾病等原因造成的骨缺损十分常见，尤其是肢体创伤所造成的骨缺损发病率高达10%，骨缺损的治疗和修复是骨科临床常见的难症之一。已有研究表明长管状骨骨干的直径决定了骨缺损能否自行愈合的长度，当骨缺损长度超过其直径的1.5 2. 5倍时即难自行愈合，需要植骨材料修复。但目前临床使用的骨修复材料各有利弊，尚不能达到修复骨缺损理想材料的要求。近年来随着骨组织工程技术的发展，构建有生命活性的组织工程化复合材料的研究有了一定的进展，这无疑将会对临床治疗骨缺损带来重大的科学意义和实用价值。组织工程骨的构建基本方法为将体外培养的种子细胞-成骨细胞复合接种到作为细胞外基质的支架材料上，经过体内或体外培养构建成组织工程骨，植入体内进行骨缺损的修复。目前骨组织工程研究中最大的问题是支架材料的选择。骨组织工程所需支架材料应具有以下特点(1)具有良好的生物活性和生物降解性，在体内的降解产物对人体无害；(2)具有一定的骨诱导性和骨传导性，利于细胞贴附与增殖；(3)具有一定强度，在机体内保持自身形状并能对抗外力；(4)易于塑形，可根据需要加工成各种形状和大小；(5)具有负荷最大量细胞的高渗透性；(6)支持成骨细胞生长和功能分化的表面化学性质与微结构；(7)可与其他生物活性分子如骨形态发生蛋白复合、控释从而对种子细胞的生长进行调控；(8)易消毒。目前骨组织工程支架材料来源可分为无机材料和有机材料两类。无机材料主要是指生物陶瓷类材料。这类材料主要由钙、磷元素组成，与人体内主要无机成分类似，故具有良好的生物相容性、生物降解性以及骨传导性。但是这类材料的最大缺陷在于降解极其困难，影响了新生骨的生成和改建。有机类材料可分为天然与人工有机材料。天然有机材料包括胶原、壳聚糖、纤维蛋白凝胶等，这类材料的共性是生物相容性好，利于细胞贴附、增殖、分化，但是作为骨组织工程支架机械强度不够，降解时间难以控制。因此将纳米级羟基磷灰石与具有骨诱导活性的有机大分子复合构建与天然骨类似的复合骨替代材料已成为当前的研究趋势。组织工程修复均属于血管形成过程，是一个多因子协调作用的复杂调控过程。目前认为毛细血管形成过程中，Ang-I、Ang-2及VEGF这三种因子发挥重要作用，构成Ang/血管生成素受体信号传导途径。当机体启动血管生长时，首先是VEGF与VEGF受体结合，引发内皮细胞增生并迁移，内皮细胞相互作用形成幼稚管腔，逐渐发育形成毛细血管。骨髓基质干细胞(BMSCs)是骨组织工程临床应用良好的种子细胞来源。若将VEGF基因转入BMSCs 中，就有可能使BMSCs在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成与长入，有利于血管化组织工程骨的新生，提高组织工程骨修复骨缺损的效果，并解决了活体直接应用VEGF不能长久保持其活性且价格昂贵等问题。
本发明的申请人曾于2009年06月10日申请过一项发明专利，公开号为CN 101085374A，发明名称为“一种组织工程化骨复合体及应用”，公开了一种组织工程化骨复合体，是由呈多空状且孔径间贯通的人工骨支架及植入孔中的转染有血管内皮细胞生长因子基因的骨髓间充质干细胞组成的，其可作为骨缺损修复材料应用，可使种子细胞在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成或长入，为新骨生成提供物质基础， 有利于血管化组织工程骨组织的新生，提高组织工程骨组织修复骨缺损的效果。但其存在以下缺陷羟甲基壳聚糖粘度大，不易降解。中国专利申请200910229016. 9，公开号为CN102085391A的发明专利申请公开
了一种羟基磷灰石/壳聚糖-丝素蛋白纳米复合材料，其权利要求1为羟基磷灰石/壳聚糖一丝索蛋白纳米复合材料，其特征在于将产物HA/Chs-SF中各组分的质量比定为 HA Chs SF= (60 80) (10 20) (10 20)，氢氧化钙和磷酸水溶液按经基磷灰石中Ca/P的化学计量比混合，并与混合在一起的丝素蛋白、壳聚糖溶液进行共沉淀反应，利用此素蛋白与壳聚糖复合有机模板对IIA结晶的成核和生长的调控作用，保证纳米队粒子在复合有机基质中的均勻分散，实现无机与有机组元在分子水平的复合，形成与天然骨相似的三维网状结构的纳米复合材料。但其存在以下缺陷制备过程中没有加入造孔剂或者采用其他有效的造孔方法，因而所得复合材料气孔率及孔径分布无法控制；此外该专利没有添加细胞及生长因子，所得复合材料无法直接应用于骨组织修复。

发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种羟基磷灰石基生物复合支架及其制备方法，以及由其构建的组织工程骨。本发明以粒子浙滤和真空干燥的方法获得了一种以羟基磷灰石为基体，丝素蛋白与壳聚糖为增强相的具有三维网络结构的多孔复合支架材料，同时，依照组织工程骨复合体的三要素(支架材料、种子细胞、信号因子)的原则，利用基因转染技术将VEGF转染BMSCs植入复合材料内，构建了一种新型组织工程骨，使BMSCS在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，促进血管化，从而提高骨缺损修复的效率。本发明可以为研制理想的骨缺损修复替代材料提供一定的实验依据和理论基础。本发明是通过以下技术方案实现的一种羟基磷灰石基生物复合支架，是由羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖构成的，其中，各组分的质量比为HA SF CS=(⑶ 8O) (10 2O) (10 2O)，复合支架呈多孔状，孔隙率为70 90%，孔径尺寸150 200 μ m，以圆形为主，孔与孔之间相互贯通。所述羟基磷灰石基生物复合支架的制备方法，包括以下步骤(1)将桑蚕茧去蛹、清洗，按照浴比(10 20) 1(质量比)置于0.01 O.lmol/ L的碳酸钠溶液中煮沸30 90min，然后用去离子水洗涤、干燥，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白，得到丝素蛋白；(2)按最终产物中 HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于氯化钙-乙醇-水三元溶液中，50 90°C搅拌20 60min，至完全溶解，得丝素蛋白溶液，置于三口烧瓶中，备用；其中，三元溶液中，氯化钙 乙醇水的摩尔比为1:2:8;(3)以氯化钙为钙源，按照羟基磷灰石中Ca/P摩尔比为1. 67配置磷酸氢二铵溶液，其中，磷酸氢二铵的浓度为0. 5 2mol/L ；(4)按最终产物中 HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例，将上述磷酸氢二铵溶液逐滴加入到丝素蛋白溶液中，30 90°C下机械搅拌反应1 6h， 再在室温下静置陈化10 48h，反应过程中通过氨水调节并控制反应液的pH值在8 11 ； 反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性后再用无水乙醇洗涤，干燥，得到纳米级弱结晶的羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体；(5)向上述所得的羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体中加入无水乙醇，搅拌成糊状， 得羟基磷灰石/丝素蛋白无水乙醇胶体，其中，羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体与无水乙醇的质量比为1 (0.5 2)；(6)按最终产物中 HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例称取壳聚糖，按照壳聚糖乙酸溶液质量比1 (15 20)将其溶解于乙酸浓度为0.01 0. 04g/mL的乙酸溶液中；(7)将上述配置好的壳聚糖乙酸溶液加入到步骤(5)中的羟基磷灰石/丝素蛋白无水乙醇胶体中，搅拌，超声分散，得到均勻的复合溶胶；(8)按质量比(羟基磷灰石+丝素蛋白+壳聚糖)氯化钠=1 (0.5 2)， (丝素蛋白+壳聚糖)京尼平=1 (10 50)的比例，将粒径为150 250 μ m的氯化钠颗粒以及京尼平加入到上述复合溶胶中，搅拌、注模，室温下静置10 Mh，然后置于真空干燥箱中干燥，得复合材料；(9)将所得复合材料脱模后，室温下置于去离子水中浸泡1 4h，然后真空干燥； 重复该步骤(指在去离子水中浸泡和真空干燥步骤)3 5次，然后将氯化钠颗粒浙滤干净，即得到羟基磷灰石基生物复合支架。一种由羟基磷灰石基生物复合支架构建的组织工程骨，是由转染VEGF基因的 BMSCs植入羟基磷灰石基生物复合支架上构建而成的。本发明所植入的转染VEGF基因的BMSCs同发明专利CN101085374A中所用的一致，在此不再赘述。本发明的有益效果如下本发明以羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖为原料，采用粒子浙滤结合真空干燥工艺制备羟基磷灰石基生物复合支架材料，通过调节各组员比例调节支架的降解速率，通过调节氯化钠颗粒的半径及加入量控制复合材料内孔径分布。与现有技术相比，本发明所得支架降解率及孔径分布更容易控制，分布更理想，且具有良好的力学性能。本发明所得组织工程骨使BMSCs在发挥成骨作用的同时，表达分泌VEGF，从而促进血管的生成与长入，有利于血管化组织工程骨的新生，提高组织工程骨修复骨缺损的效果，并解决了活体直接应用VEGF不能长久保持其活性且价格昂贵等问题。


图1为HA/SF-CS复合材料XRD分析。图2为HA/SF-CS复合材料SEM分析。图3为组织工程骨植入1周后X光照片。图4为组织工程骨植入12周后X光照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1制备羟基磷灰石基生物复合支架步骤如下(1)将桑蚕茧去蛹、清洗，按照浴比10 1置于0. 02mol/L的碳酸钠溶液中煮沸 30min，然后用去离子水洗涤，除去对人体组织有致敏反应的丝胶蛋白，得到丝素蛋白(2)按最终产物中HA SF CS = 8 1 1，称取上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于氯化钙-乙醇-水三元溶液中，80°C搅拌30min，至完全溶解，得丝素蛋白溶液，将之置于三口烧瓶中备用；其中，三元溶液中，氯化钙乙醇水的摩尔比为1:2:8;(3)以氯化钙为钙源，按照Ca/P摩尔比为1. 67配置浓度为0. 5mol/L的磷酸氢二铵溶液；(4)将磷酸氢二铵溶液逐滴加入到丝素蛋白溶液中，60°C下机械搅拌反应2h，室温静置陈化16h，反应过程中通过氨水调节并控制反应液的pH值在9 ；反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性后再用无水乙醇洗涤、干燥，得到纳米级弱结晶的羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体；(5)向上述所得的羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体中按照质量比1 0.7加入无水乙醇，搅拌成糊状；(6)按最终产物中HA SF CS = 8 1 1称取壳聚糖，按照1 20的比例将其溶解于浓度为0. 02g/mL的乙酸溶液中；(7)将配置好的壳聚糖乙酸溶液加入到步骤(5)中得羟基磷灰石/丝素蛋白无水乙醇胶体中，搅拌，超声分散，得到均勻的复合溶胶；(8)按照质量比(羟基磷灰石+丝素蛋白+壳聚糖)氯化钠为1 1，(丝素蛋白+壳聚糖)京尼平为1 30，将粒径为200μπι的氯化钠颗粒以及京尼平加入到上述复合溶胶中，搅拌、注模，室温下静置20h，然后置于真空干燥箱中干燥，得复合材料；(9)将所得复合材料脱模后，室温下置于去离子水中浸泡2h，然后真空干燥；重复该步骤3次，将氯化钠颗粒浙滤干净，即得到羟基磷灰石基生物复合支架。 实施例2制备羟基磷灰石基生物复合支架重复实施例1，其中HA SF CS比改为7 2 1。实施例3制备羟基磷灰石基生物复合支架重复实施例1，其中(羟基磷灰石+丝素蛋白+壳聚糖)氯化钠质量比改为 1 1.5。上述三个实施例所得羟基磷灰石/丝素蛋白-壳聚糖复合支架进行下列检测XRD与FT4R检测证实复合支架由羟基磷灰石、丝素蛋白、壳聚糖三相构成，如图 1所示；经过JEM-lOOCx II SEM分析表明复合支架中中孔与孔之间相互贯通，气孔率均超过70%，平均孔径在150 200 μ m(图2)；经深圳三思万能材料试验机检测复合支架抗压强度均超过150MPa，符合骨支架复合材料的要求。
实施例4构建组织工程骨及相关性能检测步骤如下(1)由NCBI gene bank获得兔的VEGF基因序列，利用分子生物学的原理和方法， 自兔组织提取总RNA，根据合成的引物，反转录制备VEGF cDNA片段。与载体相连接，通过脂质体构建pcDNA3. I-VEGF质粒。抽取成年兔骨髓进行体外细胞培养、传代获得BMSCs。将构建的VEGF质粒导入BMSCs。(2)取实施例1中制备的HA/SF-CS复合支架，然后通过常规方法将转染VEGF基因的BMSCs植入支架内，即得到组织工程骨。(3)建立兔桡骨中段15 20mm长的骨缺损模型(建模方式与发明专利 CN101085374A中一致)，采用X射线方法观察转染VEGF的BMSCs复合HA/SF-CS的成骨情况。植入组织工程骨1周后如图3所示，骨缺损明显；4周可见支架部分降解；植入12 周后如图4所示，可见降解显著，骨组织周围血管生长丰富，开始生成新骨，骨髓腔贯通，修复良好，基本愈合，自体骨形成。另外，实验中未发生明显异常反应，支架生物相容性良好。
权利要求
1.羟基磷灰石基生物复合支架，其特征在于是由羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖构成的，其中，各组分的质量比为HA SF CS= (60 80) (10 20) (10 20)，复合支架呈多孔状，孔隙率为70 90%，孔径尺寸150 200 μ m,以圆形为主，孔与孔之间相互贯通。
2.根据权利要求1所述的羟基磷灰石基生物复合支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)将桑蚕茧去蛹、清洗，按照浴比(10 20) 1置于0. 01 0. lmol/L的碳酸钠溶液中煮沸30 90min，然后用去离子水洗涤、干燥，得到丝素蛋白；(2)按最终产物中HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例， 将上述脱胶处理后的丝素蛋白溶于氯化钙-乙醇-水三元溶液中，50 90°C搅拌20 60min，至完全溶解，得丝素蛋白溶液，备用；其中，三元溶液中，氯化钙乙醇水的摩尔比为 1 2 8 ；(3)以氯化钙为钙源，按照羟基磷灰石中Ca/P摩尔比为1.67配置磷酸氢二铵溶液，其中，磷酸氢二铵的浓度为0. 5 2mol/L ；(4)按最终产物中HA SF CS= (60 80) (10 20) (10 20)的比例，将上述磷酸氢二铵溶液逐滴加入到丝素蛋白溶液中，30 90°C下机械搅拌反应1 他，再在室温下静置陈化10 48h，反应过程中通过氨水调节并控制反应液的pH值在8 11 ；反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性后再用无水乙醇洗涤，干燥，得到羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体；(5)向上述所得的羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体中加入无水乙醇，搅拌成糊状，得羟基磷灰石/丝素蛋白无水乙醇胶体，其中，羟基磷灰石/丝素蛋白复合粉体与无水乙醇的质量比为1 (0. 5 2)；(6)按最终产物中HA SF CS = (60 80) (10 20) (10 20)的比例称取壳聚糖，按照壳聚糖乙酸溶液质量比1 (15 20)将其溶解于乙酸浓度为0.01 0. 04g/mL的乙酸溶液中；(7)将上述配置好的壳聚糖乙酸溶液加入到步骤(5)中的羟基磷灰石/丝素蛋白无水乙醇胶体中，搅拌，超声分散，得到均勻的复合溶胶；(8)按质量比(羟基磷灰石+丝素蛋白+壳聚糖)氯化钠=1 (0.5 幻，(丝素蛋白+壳聚糖)京尼平=1 (10 50)的比例，将粒径为150 250 μ m的氯化钠颗粒以及京尼平加入到上述复合溶胶中，搅拌、注模，室温下静置10 Mh，然后置于真空干燥箱中干燥，得复合材料；(9)将所得复合材料脱模后，室温下置于去离子水中浸泡1 4h，然后真空干燥；重复该步骤3 5次，然后将氯化钠颗粒浙滤干净，即得到羟基磷灰石基生物复合支架。
3.一种由权利要求1所述的羟基磷灰石基生物复合支架构建的组织工程骨，其特征在于是由转染VEGF基因的BMSCs植入羟基磷灰石基生物复合支架上构建而成的。
全文摘要
本发明公开了一种羟基磷灰石基生物复合支架，是由羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖构成的，其中，各组分的质量比为HA∶SF∶CS＝(60～80)∶(10～20)∶(10～20)，复合支架呈多孔状，孔隙率为70～90％，孔径尺寸150～200μm，以圆形为主，孔与孔之间相互贯通。本发明还公开了一种由羟基磷灰石基生物复合支架构建的组织工程骨，是由转染VEGF基因的BMSCs植入羟基磷灰石基生物复合支架上构建而成的。本发明以羟基磷灰石、丝素蛋白和壳聚糖为原料，采用粒子沥滤结合真空干燥工艺制备羟基磷灰石基生物复合支架材料，通过调节各组员比例调节支架的降解速率，通过调节氯化钠颗粒的半径及加入量控制复合材料内孔径分布。
文档编号A61L27/54GK102302804SQ201110260650
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者卢志华, 赵冬梅 申请人:济宁学院