专利名称：卵内接种抗球虫病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及给家禽接种抗球虫病疫苗的方法。具体地说，本发明涉及向家禽的发育卵内投用活的艾美球虫(Eimeria spp)子孢子或裂殖子或其混合物以免疫孵化的鸡，使之产生抗球虫病免疫力。
球虫病是一种由艾美球虫属的细胞内原生动物寄生虫感染引起的家禽肠道疾病。球虫病是经济上损害巨大的家禽寄生虫病。据估计，每年因使用抗球虫病药物的花费及由于球虫病给家禽养殖业造成的损失多达数亿美元。
早在50年代即已有试图给家禽接种抗球虫病疫苗的报导。目前的疫苗接种方法包括通过饲料和水给禽类投用活的艾美球虫卵囊。然而，由于并不是所有禽类都得到预定剂量的卵囊，并且许多禽类未受到疫苗的保护或者接受病原感染，所以这些方法是很不方便而且无效的。
在J.M.Sharma and B.R.Burmester，Avian Dis，26134-149，1981中，作者报导了卵内接种火鸡疱疹病毒的鸡发展了对抗继后Marek氏病病毒攻击的免疫力。在欧洲专利公开NO，291173中描述了卵内投用非复制性免疫原的免疫方法。该欧洲专利中具体提到的免疫原是基因工程产生的艾美球虫抗原和艾美球虫卵囊提取物。该欧洲专利特别排除了活寄生虫阶段的抗原，例如用于本文要求保护之接种方法中的那些抗原。
本发明疫苗接种方法包括向家禽的发育卵内卵内投用活艾美球虫子孢子或裂殖子，或其混合物。可获得的文献提示，这样的卵内疫苗接种方法是无效的并且应在孵化后应用。在T.K.Jeffers andG.E.Wagenbach，J.Parasit.56(4)656-662，1970中，在保温第10天卵内注射禽艾美球虫(E.tenella)子孢子没有提供对抗继后E.tenella卵囊攻击的显著的免疫学保护作用。事实上，他们报导没有接受处理的鸡在经受继后E.tenella卵囊攻击后，比已用子孢子卵内处理的鸡有更高的存活率。在K.L.Watkins et al.，Proc.Vl th.InternationalCoccidiosis Conf.，Abstract E1-2，Ontario，Canada，1993中，作者描述了卵内接种活的最大艾美球虫(E.maxima)孢子囊和形成孢子之卵囊的方法，结论是他们的研究没有为进行卵内接种可保护家禽在孵化后第10天免于遭受最大艾美球虫攻击提供证据。他们还认为，如果在孵化后很快接种而不是卵内接种，可提供显著的免疫学保护作用。与这一教导相反，本发明的卵内接种疫苗的方法则提供了不可预见的免疫力，从而保护孵化的家禽免于遭受继后的球虫攻击。
本发明—本文也称为″本疫苗接种方法″—涉及给家禽进行疫苗接种以对抗球虫病的方法，包括在孵育的最后四分之一期间，卵内投用有效免疫剂量的活艾美球虫子孢子或裂殖子，或其混合物。
本文所使用的术语″家禽″，除另外说明之外，包括鸡、火鸡、鸭、狩猎野禽(包括但不只限于雉、鹌鹑、及鹅)和平胸鸟(包括但不只限于鸵鸟)。
除特别说明外，术语″卵内″是指进入含有活的发育期胚胎的家禽卵。
除另有说明之外，本文所使用的术语″卵内投用″是指借助穿透卵壳并导入疫苗的任何方法给含有活的发育期胚胎的家禽投用本文所述的疫苗。这种投用方法包括但不只限于注射疫苗。
除另有说明之外，本文所使用的术语″孵育的最后四分之一期间″是指家禽的发育卵的最后四分之一孵育期间。
除另有说明之外，本文使用的术语″艾美球虫″是指感染家禽的一个种或多个种的艾美球虫属球虫。这样的艾美球虫种包括发现于鸡中的禽艾美球虫(E.tenella)、E.acervulina、E.maxima、扁嘴艾美球虫(E.necatrix)、E.mitis、E.praecox和E.brunetti，以及发现于火鸡中的E.meleagrimitis，E.adenoeides、E.gallopavonis、E.dispersa、E.meleagridis、E.innocua和E.subrotunda，以及还有感染如上文所述其他家禽的其他种的艾美球虫。术语″艾美球虫″还包括前述艾美球虫种的所有品系，包括但不只限于早熟品系、减毒品系、其中又包括经过照射处理或其他处理从而没有完全发育的品系。术语″艾美球虫″还包括新发现的感染上述家禽的品系或艾美球虫种。
除另有说明之外，本文所用的术语″子孢子″、″孢子囊″、″卵囊″和″裂殖子″是指活的艾美球虫子孢子、孢子囊、卵囊和裂殖子。
除非另外指出，本文所用的术语″有效免疫剂量″是指子孢子或裂殖子的数目，或当混合时子孢子和裂殖子的数目足以在孵化的家禽体内提供比非经免疫家禽的固有免疫力更大的免疫学保护作用。本文所使用的术语″免疫″和″疫苗接种″是同义词并可以相互代用。
按照本发明的方法投用的优选剂量包括10至106个子孢子或裂殖子，或者其中所说子孢子和裂殖子的总数为10至106个的混合物。
更优选的剂量包括103至106个子孢子或裂殖子，或者其总数目为103至106个的所说子孢子与裂殖子的混合物。
另一个优选剂量包括102至105个子孢子或裂殖子，或者其总数目为102至105的所说子孢子与裂殖子的混合物。
按照本发明的方法进行疫苗接种的优选家禽是鸡。
向鸡卵内投用的优选剂量内包含选自禽艾美球虫、E.acervulina、E.maxima、扁嘴艾美球虫、E.mitis、E.praecox和E.brunetti中之两个种或多个种的艾美球虫的子孢子或裂殖子，或其混合物。对于包含于每个剂量中的每个种的艾美球虫而言，优选剂量包括10至106个子孢子或裂殖子，或其混合物。
按照本发明的方法进行疫苗接种的另一种优选家禽是火鸡。
向火鸡卵内投用的优选剂量内包含选自E.meleagrimitis、E.adenoeides、E.gallopavonis、E.dispersa、E.meleagridis，E.innocua和E.subrotunda中之两个种或多个种的艾美球虫的子孢子或裂殖子，或其混合物。对于包含于每个剂量中的每个种的艾美球虫而言，优选剂量包含10至106个子孢子或裂殖子，或其混合物。
按照本发明的方法进行疫苗接种的其他优选家禽是狩猎野禽、鸭和平胸鸟。
本发明的方法进一步包括与本疫苗接种方法联合，在孵育的任何时间卵内投用免疫刺激剂。
投用免疫刺激剂的优选方法是在孵育的最后四分之一时间里与卵内投用子孢子或裂殖子，或所说子孢子和裂殖子的混合物的同时进行投用。
本疫苗接种方法包括在孵育的最后四分之一时间里向家禽卵内投用活的艾美球虫子孢子或裂殖子，或其混合物。就鸡来说，卵内投用较好是在孵育的第15-20天进行，最好在孵育的第18天进行。就火鸡来说，卵内投用较好是在孵育的第21-26天进行。
可以使用任何一种适用卵内给药的方法完成本疫苗接种方法。本疫苗较好是通过注射投用。按照一种注射方法，使用18号针头在卵的大端卵壳上刺一个孔以暴露卵的气室。可通过该孔并通过气室的膜插入一个连接到适当大小(1-3ml)之注射器上的1.0-1.5英寸22号针头。将适当数目的子孢子或裂殖子，或当两者混合时将适当数量的子孢子和裂殖子悬浮于适当的液体载体，例如10-500μl磷酸盐缓冲盐水中，然后注入卵内。适宜的体积将取决于被处理卵的大小，显然驼鸟卵可比鸡卵摄取更大的体积。注射部位可在卵或胚胎的任何区域内。进行注射时较好是通过卵之大端的中心轴向进入羊膜内。
另外，本疫苗接种方法中也可使用自动卵注射系统。美国专利No，4,681,063、4,040,388、4,469,047和4,593,646(均列为本文参考文献)中描述了这样的系统。其他适当的注射方法是本领域技术人员已知的。
可用本领域技术人员已知的几种方法中的任何一种方法制备卵囊，其中包括J.F.Ryley et al.，Parasitology 73311-326，1976和P.L.Long et al.，Folia Veterinaria Latina V1#3，201-217，1976(均列为本文参考文献)中所描述的方法。按照一种方法，经管饲法口服适当量的形成孢子的卵囊，用特定种的艾美球虫感染约2周龄的市售肉用子鸡。例如，禽艾美球虫(E.tenella)的典型使用剂量为200,000个形成孢子的卵囊/家禽。然后按照已知的方法收集和纯化被感染家禽的卵囊。对于大多数种的艾美球虫来说，感染后5-7天收集被感染家禽粪便，搅拌并过滤除去残渣，然后以足以沉淀余留粪便材料的速度离心。对于禽艾美球虫也使用相似的方法，但在感染后第6天取盲核(cecal cores)。将离心沉淀物重新悬浮在饱和盐溶液中，在其中可经离心除去卵囊悬浮物和大部分污染的碎片。然后将卵囊悬液稀释到较低的盐浓度。反复洗卵囊以除去盐并再次悬浮于重铬酸钾溶液(2.5％W/V)中。振荡下(如140rpm)于29℃将卵囊悬液保温约72小时以诱导卵囊的孢子形成。或者，也可使用次氯酸钠溶液处理卵囊，然后使之形成孢子。使用血细胞计数器直接计数以确定每毫升中形成孢子之卵囊的数目，优选在冷冻条件下贮存培养物备用。
为了制备孢子囊，经反复清洗卵囊而从上述卵囊悬液中除去重铬酸钾，清洗方法包括离心收集卵囊并重新悬浮于去离子水或蒸馏水中。在根据没有澄黄颜色判定已去掉了重铬酸盐之后，将卵囊悬液与等体积次氯酸钠(漂白剂)混合并于室温下孵育15分钟。经反复洗涤除去漂白剂，并将卵囊重新悬浮在生理盐水或去离子水中。可使用各种已知技术破坏卵囊以释放出孢子囊。例如，可将卵囊与直径1-4mm的玻璃珠混合，并用手动、涡旋混合器、或振荡孵育器振荡，或者使用手动匀浆器破坏卵囊以释放孢子囊。可以按Dulski etal.，Avian Diseases，32235-239，1988中所述的方法，在50％PercollTM(由Pharmacia Biotech出售)或1M蔗糖中经差速离心从释放的孢子囊中分离出未被破坏的卵囊和卵囊壁。
为了制备将按照本发明使用的子孢子或富含子孢子的制剂，使子孢子从上述孢子囊制剂中脱囊。一种方法是，离心沉淀按上述方法制备的孢子囊，重新悬浮于脱囊缓冲液(0.5％牛脱氧磺胆酸和0.25％胰蛋白酶，加在磷酸盐缓冲盐水(pH8.0中)中并于41℃振荡孵育1小时。计数所得悬液的样品以确定子孢子的数目，将子孢子洗一次以除去脱囊缓冲液，并以卵内注射所需的浓度重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中。该制剂含有子孢子、孢子囊及卵囊，并且不经进一步纯化即可按本发明接种方法使用。可以用D.M.Schmatz et al.，J.Protozool.31181-183，1984(列为本文参考文献)中所述的DE-52阴离子交换层析法从孢子囊和卵囊中分离出纯化的子孢子。用于本疫苗接种方法中之子孢子的剂量将依据被接种之家禽的类型和用于疫苗中之艾美球虫的品种的不同而有所变化。一般说来，该剂量范围可以为每只卵10至106个子孢子，较好是每只卵10至105个子孢子，最好是每只卵102至105个子孢子。
可用本领域技术人员已知多种方法制备裂殖子。一种方法是，使用D.J.Doran.，J.Parasit.57891-900，1971(列为本文参考文献)中描述的改进方法，将子孢子感染到作为细胞凝集体生长于培养基中的初级鸡肾细胞(PCK)中。PCK细胞在3％CO2环境下于40℃生长于如S.D.Chung et al.，J.Cell Biol.95118-126，1982中所述的添加了胎牛血清、青霉素-链霉素、15mM碳酸氢钠、10ng/ml表皮生长因子、5μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml亚硒酸和0.01μM盐酸氢化可的松的含L-谷氨酰胺及15mMHEPES的改良RK2培养基-DMEM/F12中。经切碎鸡肾脏，然后用加在磷酸盐缓冲盐水溶液中的0.2mg/ml胶原酶(由Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ出售)于37℃将组织处理几次，以从2至3周龄鸡的肾脏制备PCK。洗涤上清液中的细胞聚集体，重新悬浮在含有5％胎牛血清的改良的RK2培养基中，并用于以每cm2含105个聚集体的密度接种组织培养瓶。于3％CO2环境中将PCK细胞40℃保温18小时，然后用4×105子孢子/cm2感染之。在含有2％胎牛血清的改良的RK2培养基中培养被感染的培养物。保温24小时后，使之侵染，搅动培养物并除去培养基来除去未受侵染的子孢子。用含有2％胎牛血清的改良的RK2培养基将细胞层洗一次并再次弃去培养基。加入新鲜RK2培养基，并将培养物继续保温48至54小时，直到裂殖子释放到培养基中。
可用本领域技术人员已知的多种已知方法纯化裂殖子以除去宿主细胞碎片。按照如J.A.Olson，Antimicrob.AgentsChemother.341435-1439，1990中所述的方法，收集含有释放之裂殖子的培养基，并以450xg旋转10分钟以浓缩裂殖子。将含有裂殖子和宿主细胞碎片的沉淀物悬浮在0.1M NaCl-0.05M KCl-20％牛血清白蛋白中，并加样于用75mM Tris-40mMNaH2PO4-86mM NaCl-100mM葡萄糖(pH8.2)平衡的DE-52阴离子交换柱上。裂殖子流经层析柱。可按A.Kilejian，J.Biol.Chem.2494650-4655，1974中所述的方法，用电子显微镜检查从柱上收集之裂殖子的纯度。一般说来，裂殖子剂量可在每只卵10至106个裂殖子范围内，较好为每只卵10至105个裂殖子，最好每只卵102至105个裂殖子。当子孢子和裂殖子混合时，该剂量一般包含每只卵总共10至106个裂殖子和子孢子，较好为每只卵共10至105个裂殖子和子孢子，最好为每只卵共102至105个裂殖子和子孢子。
可以将子孢子或裂殖子或其混合物加在任何适当的生理介质中进行卵内注射。较好将其加在生理平衡盐水如磷酸盐缓冲盐水中。选用介质可选择地包含包括生理上适用的凝胶、白明胶、水溶胶、纤维素或多糖树胶等的一种或多种悬浮剂。
在本疫苗接种方法中，较好在同一时间卵内注射两个或多个艾美球虫种的子孢子或裂殖子或其混合物。按照本疫苗接种方法，可以在同一时间或连续以适当的剂量卵内注射感染特定家禽如鸡的所有已鉴定种之艾美球虫的子孢子或裂殖子，或其混合物，以提供对抗所有种之艾美球虫的免疫学保护作用。
在本疫苗接种方法中可联合使用免疫刺激剂。适用的免疫刺激剂包括但不只限于细胞因子、生长因子、趋化因子、淋巴细胞、单核细胞或淋巴样器官之细胞培养物的上清液，细胞制剂或细胞提取物(例如金黄色葡萄球菌或脂多糖制剂)、促细胞分裂原、或包括低分子量药物的佐剂。可以在孵育期间的任何时候卵内投用免疫刺激剂。较好将免疫刺激剂加在含有艾美球虫子孢子或裂殖子或其混合物的介质中投用。
下列实施例举例说明了本发明抗球虫病疫苗接种的效力。将每剂疫苗加于上述生理上可接受的盐水内进行卵内注射。经监测其对孵化率和鸡破壳体重、以及攻击感染、卵囊产生、体重增加和病原性(损伤记分)的影响，以确定特定制剂的效力。按照J.K.Johnson andW.M.Reid，Exp.Parasitol.2830-36，1970中所述的方法确定损伤分数，其中O值代表没有疾病，4分代表最大病理学改变。
实施例1于孵育的第18天用每只卵含有105个禽艾美球虫子孢子的制剂对鸡卵进行卵内注射。该制剂没有经纯化除去孢子囊和卵囊。各剂还含有大约104个禽艾美球虫孢子囊和大约104个禽艾美球虫卵囊。作为对照卵，只注射磷酸盐缓冲盐水溶液。在子孢子处理的家禽群体中，孵化后第7天平均脱出的卵囊为每只家禽1.1×106个卵囊。在孵化后第7、14或21天经口内管饲法用各种不同剂量的禽艾美球虫形成孢子的卵囊，攻击未经免疫的和子孢子处理的家禽。数据示于表1中。
表1免疫的对未免疫的家禽在孵化后不同时间对不同攻击剂量的反应
1.孵化后第7、14或21天对各组进行形成孢子之卵囊的单一攻击。例如，在孵化后第21天攻击的家禽未在孵化后第7或14天受到攻击。*与未经免疫的家禽有显著性差异(P＜0.05，ANOVA)。
如由经免疫的家禽减少了损伤数并改善了体重增加量所指示的，表1的数据表明经免疫的家禽比未经免疫的对照家禽对感染的敏感性小。数据还证明，本发明的方法可在相对早的龄期(孵化后7天之内)给鸡赋予了免疫力。再者，数据表明随着鸡的生长和发育，免疫力仍持续存在。由于肉用子鸡通常在6周龄上市，所以在较早龄期给鸡赋予免疫力在肉用子鸡生产工业中具有重要意义。
实施例2如提供了预攻击结果的表2中所指出的，在孵育的第18天，对鸡卵注射盐水(对照组)或含有不同剂量禽艾美球虫子孢子的制剂。所使用的子孢子制剂每剂含有62％子孢子、9％孢子囊和29％卵囊。含105个子孢子的每一剂量中包含总共1.6×105个不同生活阶段的寄生虫(子孢子、孢子囊和卵囊)。
表2卵内疫苗接种对孵化率和体重的影响
表2中所示数据表明，就孵化率和孵化体重来说，从注射了活子孢子的卵孵化的鸡实质上与未经免疫的卵孵化出的对照鸡相同。然后于孵化后第14天用每只卵1.25×104个禽艾美球虫形成孢子的卵囊，以经口管饲投用的方法攻击鸡。攻击后的结果示于表3中。
表3未经免疫的家禽与用不同剂量子孢子卵内处理的家禽对攻击感染的反应的比较
*与受到攻击的未经免疫组(接受了盐水的)有显著性差异(P＜0.05，ANOVA)。
表3中的数据显示，从注射了不同剂量子孢子制剂的卵孵化之鸡的各参数(体重增加、损伤分数、卵囊脱出)均提供了其产生免疫力的证据。与只用盐水处理并受到攻击感染的对照组家禽相比，用子孢子制剂卵内免疫的家禽显示更大的体重增加和减少了的损伤分数。另外，用子孢子制剂卵内免疫的家禽在攻击感染后比对照组家禽排出了较少的卵囊，表明经免疫的家禽遭受感染的程度较小。
权利要求
1.给家禽接种抗球虫病疫苗的方法，其包括在孵育的最后四分之一期间内卵内投入有效免疫剂量的活艾美球虫子孢子或裂殖子，或其混合物。
2.如权利要求1的方法，其中剂量包含10到106个子孢子或裂殖子，或其中所说的子孢子和裂殖子总数范围为10到106个的混合物。
3.如权利要求1的方法，其中剂量包含103到106个子孢子或裂殖子，或其中所说的子孢子和裂殖子总数范围为103到106个的混合物。
4，如权利要求1的方法，其中剂量包含102到105个子孢子或裂殖子，或其中所说的子孢子和裂殖子总数范围为102到105个的混合物。
5，如权利要求2的方法，其中家禽是鸡。
6，如权利要求5的方法，其中所说的剂量中包含选自禽艾美球虫、E.acervulina、E.maxima、扁嘴艾美球虫、E.mitis、E.Praecox和E.brunetti之两个或多个种的艾美球虫的子孢子或裂殖子或其混合物。
7.如权利要求6的方法，其中所说的剂量是经卵内注射投用的。
8.如权利要求2的方法，其进一步包括在孵育期间的任何时候卵内投用免疫刺激剂。
9.如权利要求8的方法，其中与子孢子或裂殖子或所说子孢子和裂殖子的混合物同时卵内投用免疫刺激剂。
10.如权利要求2的方法，其中所说的剂量包含裂殖子。
11.如权利要求2的方法，其中所说的剂量包含子孢子。
12.如权利要求11的方法，其中子孢子已经过纯化而除去了孢子囊和卵囊。
13.如权利要求2的方法，其中家禽是火鸡。
14.如权利要求13的方法，其中所说的剂量中包含选自E.meleagrimitis、E.adenoeides、E.gallopavonis、E.dispersa、E.meleagridis、E.innocua和E.subrotunda之两个或多个种的艾美球虫的子孢子或裂殖子，或其混合物。
15.如权利要求14的方法，其中所说的剂量是经卵内注射投用的。
16.如权利要求2的方法，其中家禽是狩猎野禽、鸭或平胸鸟。
全文摘要
本发明涉及给家禽投用疫苗以对抗球虫病的方法，包括卵内投用有效免疫剂量的活的艾美球虫子孢子或裂殖子，或其混合物。在一优选实施方案中，进行疫苗接种的家禽是鸡或火鸡。
文档编号A61K35/00GK1145168SQ9611038
公开日1997年3月19日 申请日期1996年6月6日 优先权日1995年6月7日
发明者N·A·埃文斯, R·C·芬德利, F·H·韦伯 申请人:辉瑞大药厂